一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用，所述方法包括以下步骤:S1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；S2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；S3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体，上述突变植株的种子脂肪酸组成发生了显著变化。本发明专利技术所提供的方法可以不同程度改变油菜种子脂肪酸组成，为改变甘蓝型油菜种子脂肪酸组成提供了新的途径、提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。

A method of using gene editing technology to change the fatty acid composition of rape seeds and its application

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及其应用。
技术介绍
油菜是我国重要的油料作物和食用植物油来源，油菜的脂肪酸改良主要是从不同的用途展开，其中最受关注的是提高油菜油酸含量，改善菜籽油的品质，但是关于对油菜种子中脂肪酸组成的遗传改良研究很少有报道，到目前为止，尚未有利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对甘蓝型油菜硬酯酰基去饱和酶(S-ACP-D)基因进行突变改变油菜种子脂肪酸组成(C18∶0)及应用的报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的技术问题，提供一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法及应用。该方法首先根据拟南芥fab2基因对甘蓝型油菜硬酯酰基去饱和酶(S-ACP-D)基因家族进行分析，得到甘蓝型油菜中该基因的四个拷贝，通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaSAD的四个拷贝精确定点突变，最终获得了种子脂肪酸组成改变的突变体。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：本专利技术提供了一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，包括以下步骤：S1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；S2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；S3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体。其中，所述五个碱基位点的靶点序列(5＇-3＇)分别见SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10。其中，所述靶点序列的引物序列分别见SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20。其中，所述BnaSAD.C4拷贝的碱基序列如SEQIDNO：2所示；所述BnaSAD.A5拷贝的碱基序列如SEQIDNO：3所示；所述BnaSAD.A3拷贝的碱基序列如SEQIDNO：4所示；所述BnaSAD.C3拷贝的碱基序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术步骤S3中构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体的步骤包括：a.靶点接头制备；b.靶点接头引物与sgRNA表达盒的连接和扩增；c.靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体的连接；d.转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证，得到最终载体；e.将连接成功的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，得到pBnaSAD2载体农杆菌菌株。其中，所述BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因是根据拟南芥fab2基因进行基因家族分析得到的。本专利技术还提供了上述利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法在油菜育种中的应用。本专利技术具有以下有益技术效果：本专利技术通过基因家族分析得到了甘蓝型油菜中BnaSAD2基因的四个拷贝；提供了能改变油菜种子脂肪酸组成的CRISPR/Cas9系统的靶标序列T1、T2、T3、T4、T5，这五个靶点可以精确地定点编辑BnaSAD2基因的四个拷贝，通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术可以改变油菜种子脂肪酸组成。本专利技术为改变甘蓝型油菜种子脂肪酸组成提供了新的途径、提供了新的种质资源，具有良好的应用前景。附图说明图1为突变体植株PCR阳性检测鉴定结果图；图2为阳性单株PCR编辑检测结果图。图3为pBnaSAD2载体的示意图。具体实施方式以下结合具体实施方式对本专利技术进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。本专利技术所用的试剂均市售可得，所用载体、质粒均为本领域公知公用。下述实施例中涉及到的培养基如下：LB培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，固体培养基加琼脂15g/L，121℃高压灭菌20min，4℃冰箱贮存备用。DM(100ml)：MS0.44g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，灭菌，快冷使用时加抗生素AS(100μm)100μl。M0(100ml)：1/2MS0.22g，蔗糖3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar0.7g，灭菌。M1(500ml)：MS2.2g，蔗糖15g，Mannitol9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar3.5g，灭菌，快冷使用时加抗生素AS(100μm)500μl。M2(500ml)：MS2.2g，蔗糖15g，Mannitol9g，2,4-D(1mg/L)0.5ml，KT(0.3mg/L)0.5ml，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar3.5g，灭菌，快冷使用时加STS75μl，TMT(300mg/ml)0.5ml，HygromycinB(25mg/ml)250ul。M3(500ml)：MS2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，MES0.3g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar3.5g，灭菌，快冷使用时加反式-Zeatin(2.0mg/L)0.5ml，IAA(0.1mg/L)0.5ml，TMT(300mg/L)0.5ml，AgNO375μl，HygromycinB(25mg/ml)250μl。M4(500ml)：MS4.4g，蔗糖5g，定容，调PH＝5.84-5.88，加Agar3.5g，灭菌，快冷使用时加TMT(300mg/L)0.5ml。STS:[Ag(SO3)2]3-现用现配，时间过长有沉淀。母液：硫代硫酸钠，0.1M(1.58g溶于100mLddH2O)；AgNO3，0.1M(1.7g溶于100mLddH2O)VNa2SO3:VAgNO3＝4:1，将AgNO3溶于硫代硫酸钠中。2,4-D:1mg/mL母液，0.25g2,4-D加入少量95％酒精和1M的NaOH溶液，定容至250mL。KT:0.03gKT先溶于1MHCL中，加水定容至100mL。AS:100mmol/L母液，0.392gAS先溶于少量甲醇中，再加二甲基亚砜，定容至20mL。TZ:反式Zeatin(玉米素)，2mg/mL母液，称0.04gTZ溶于少量75％酒精中，加水定容至20mL。IAA:0.1mg/mL，100mgIAA溶于少量95％乙醇中，再加ddH2O定容至100mL，抽滤分装，保存于-20℃。实施例1甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(SAD)基因同源基因分析根据拟南芥TA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；/nS2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；/nS3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，根据甘蓝型油菜BnaSAD.C4、BnaSAD.A5、BnaSAD.A3、BnaSAD.C3基因核苷酸序列设计并筛选五个碱基位点的靶点序列，并针对靶点序列设计引物；
S2，构建五靶点基因编辑载体pBnaSAD2载体；
S3，pBnaSAD2载体用受体材料甘蓝型油菜下胚轴遗传转化，获得油菜种子脂肪酸组成发生改变的突变体。


2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，其特征在于，所述五个碱基位点的靶点序列(5＇-3＇)分别见SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10。


3.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪酸组成的方法，其特征在于，所述靶点序列的引物序列(5＇-3＇)分别见SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、SEQIDNO：15、SEQIDNO：16、SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20。


4.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术改变油菜种子脂肪...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永明，黄会斌，赵青，覃萍，张莉莉，闫彤，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42