一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。本发明专利技术通过培养基、培养方法等的改进降低了农杆菌侵染液的浓度，减轻了辣椒子叶的超敏反应，有利于后续的再生过程；菌体浸染液中不添加乙酰丁香酮Acetosyringone(AS)，子叶和农杆菌固体MS共培养培养基中添加乙酰丁香酮(AS)和二硫苏糖醇Dithiothreitol(DTT)可显著促进转化效率的提高。本发明专利技术对部分基因型进行了转化验证，在大部分基因型中可显著促进转化效率的提高。表明该方法可以用于辣椒转基因和基因编辑研究中的遗传转化，进一步促进辣椒转基因植株的获得。

Agrobacterium mediated transformation of Capsicum

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法
本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。
技术介绍
植物基因组修饰自古有之，最早是利用选择育种来实现，随后是诱变育种和转基因育种，现在则是通过基因编辑来修饰目的基因从而达到育种要求。基因编辑的优势在于准确、快速、高效。多种作物中如番茄、玉米、小麦等已利用该技术进行基因功能验证和创制新的种质资源。实施该技术的基础是成熟的转基因技术体系，所以很多植物由于没有成熟的转基因技术体系，严重限制了该技术的实施和发展。辣椒属于转化和再生顽拗型植物，有些基因型获得转基因植株的概率在0.01％～0.05％，但是大部分基因型难以获得转基因植株。转化作为转基因技术体系的第一步，其效率的高低决定了后续过程中是否能够获得转基因植株。植物遗传转化的方法包括根癌农杆菌介导法、基因枪转化法及花粉管通道法、蘸花法等其他方法，由于根癌农杆菌介导法简单易行、经济高效，使用最为广泛。辣椒上多是通过根癌农杆菌介导法获得转基因植株，但是由于辣椒转化和再生具有很强的基因型依赖性导致很难建立通用的转化再生技术体系。目前文献报道的辣椒遗传转化体系为：苗龄为10-14d的幼苗子叶作为转化外植体，在预培养基中预培养2d，然后OD值为0.3～0.8的菌液悬浮液(MS液体培养基+AS20mg/L)侵染子叶外植体8-20分钟，灭菌的滤纸吸干子叶上的残留菌液，子叶置于共培养培养基上培养3d，完成农杆菌介导的遗传转化。通过试验，我们发现利用该体系进行遗传转化，大部分基因型的转化效率很低。通过调整菌液浓度、预培养时间、共培养时间等常规试验参数无法显著提高侵染效率。针对以上转化体系效率低的问题，优化和改良辣椒转化方法提高转化效率势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，包含以下步骤：(1)消毒后的辣椒种子播种于含蔗糖的固体MS培养基，取苗龄14d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化；其中，所述的固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；(2)将含有卡那霉素和利福平抗性标记的目的基因的载体转化根癌农杆菌EHA105，25℃～28℃条件下培养待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.8～1.2，取上述菌液加入包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.5～0.8；(3)将菌液在4℃，6000rpm条件下离心5min，用液体MS培养基重悬浮菌体并清洗，再次用液体MS培养基重悬菌体，调整菌体侵染液的最终浓度为OD600＝0.08-0.12；所述的液体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L，pH5.8；(4)将子叶外植体在菌体侵染液中浸染15分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中,，共培养3d，完成目的基因的遗传转化过程；所述的共培养培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L+AS15～20mg/L+DTT100～150mg/L+琼脂粉8g/L。作为本专利技术的一种优选，步骤(1)所述的固体MS培养基配方为MS基础培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L。作为本专利技术的一种优选，步骤(2)中所述的包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。作为本专利技术的一种优选，步骤(2)中取上述菌液50ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50mlLB液体培养基中。作为本专利技术的一种优选，步骤(3)中所述的液体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.43g/L+蔗糖30g/L，pH5.8。作为本专利技术的一种优选，步骤(4)中所述的固体MS共培养培养基配方为含维生素的MS基础培养基4.43g/L+蔗糖30g/L+AS20mg/L+DTT150mg/L+琼脂粉8g/L，PH5.8。作为本专利技术的一种优选，步骤(2)中所述的振荡培养条件为28℃，200r/min摇床培养。作为本专利技术的进一步优选，包含以下步骤：(1)辣椒种子无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水浸泡冲洗3次，每次5分钟。消毒后的种子播种于固体MS培养基，苗龄14d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化；(2)将含有目的基因的载体转化根癌农杆菌EHA105，28℃条件下培养下36～48h，待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含终浓度为50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基中。28℃，200r/min摇床中培养24h至OD600＝0.8～1.2，从上述菌液中取50ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50mlLB液体培养基中，28℃，200r/min摇床中培养17h～20h至OD600＝0.5～0.8；(3)将菌液在4℃，6000rpm条件下离心5min，用所述的液体MS培养基重悬浮菌体，清洗。在4℃，6000rpm条件下离心5min，弃上清，再次用所述的MS液体培养基重悬菌体，调整菌体侵染液的最终浓度为OD600＝0.08～0.12；(4)将子叶外植体在菌体侵染液中浸染15分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于所述的固体MS共培养培养基中，共培养3d，完成目的基因的遗传转化过程。有益效果：相比于目前常用的转化方法，本专利技术方法降低了农杆菌侵染液的浓度，减轻了辣椒子叶的超敏反应，有利于后续的再生过程；菌体浸染液中不添加乙酰丁香酮Acetosyringone(AS)，子叶和农杆菌固体MS共培养培养基中添加乙酰丁香酮(AS)和二硫苏糖醇Dithiothreitol(DTT)可显著促进转化效率的提高。本专利技术对部分基因型进行了转化验证，在大部分基因型中可显著促进转化效率的提高。表明该方法可以用于辣椒转基因和基因编辑研究中的遗传转化，进一步促进辣椒转基因植株的获得。附图说明图1不同化学物质对辣椒基因型A19子叶外植体转化效率的影响图24份辣椒材料在原有转化体系和本转化体系中GUS基因表达具体实施方式实施例1辣椒基因型A19作为建立农杆菌介导的辣椒转化体系的试验材料，验证在共培养培养基中添加不同化学物质对辣椒转化效率的影响，具体物质及浓度见表1，具体操作过程及结果如下所述：A19基因型种子用无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，1％的次氯酸钠浸泡30分钟，无菌水浸泡冲洗3次，每次5分钟。消毒后的种子播种于固体MS培养基(MS培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L)，苗龄14d的幼苗子叶作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，其特征在于包含以下步骤：/n(1)消毒后的辣椒种子播种于含蔗糖的固体MS培养基，取苗龄14d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化；其中，所述的固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；/n(2)将含卡纳霉素和利福平抗性标记基因和目的基因的载体转化根癌农杆菌EHA105，25℃～28℃条件下培养待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD 600＝0.8～1.2，取上述菌液加入包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD 600＝0.5～0.8；/n(3)将菌液在4℃，6000rpm条件下离心5min，用液体MS培养基重悬浮菌体并清洗，再次用液体MS培养基重悬菌体，调整菌体侵染液的最终浓度为OD 600＝0.08-0.12；所述的液体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L，pH5.8；/n(4)将子叶外植体在菌体侵染液中浸染15分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中,，共培养3d，完成目的基因的遗传转化过程；所述的共培养培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L+AS 15～20mg/L+DTT 100～150mg/L+琼脂粉8g/L。/n...

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)消毒后的辣椒种子播种于含蔗糖的固体MS培养基，取苗龄14d的幼苗子叶作为外植体，用于农杆菌介导的遗传转化；其中，所述的固体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L；
(2)将含卡纳霉素和利福平抗性标记基因和目的基因的载体转化根癌农杆菌EHA105，25℃～28℃条件下培养待长出明显的菌落，挑取阳性单克隆菌落，接种在包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.8～1.2，取上述菌液加入包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.5～0.8；
(3)将菌液在4℃，6000rpm条件下离心5min，用液体MS培养基重悬浮菌体并清洗，再次用液体MS培养基重悬菌体，调整菌体侵染液的最终浓度为OD600＝0.08-0.12；所述的液体MS培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L，pH5.8；
(4)将子叶外植体在菌体侵染液中浸染15分钟，取出置于灭菌后的滤纸上吸干残留菌液，将子叶背面朝下整齐排布于共培养培养基中,，共培养3d，完成目的基因的遗传转化过程；所述的共培养培养基配方为含维生素的MS基础培养基4～5g/L+蔗糖30g/L+AS15～20mg/L+DTT100～150mg/L+琼脂粉8g/L。


2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，其特征在于步骤(1)所述的固体MS培养基配方为MS基础培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8g/L。


3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，其特征在于步骤(2)中所述的包含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。


4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的辣椒遗传转化方法，其特征在于步骤(2)中取上述菌液50ul至包含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的50mlLB液体培养基中。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：郭广君，王述彬，刘金兵，潘宝贵，刁卫平，戈伟，高长洲，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32