一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，属于分子生物学及基因工程技术领域。本发明专利技术通过设计水稻分蘖数调控基因OsFWL4编码区基因敲除靶标位点，利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除突变体，敲除水稻中的基因OsFWL4。通过后代分离和检测，获得了无转基因插入、无可检测脱靶效应的纯合突变体。不同突变体的分蘖数和单株产量与对照相比均显著增加。因此，本发明专利技术提供的敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，具有重要的应用价值，能产生良好的经济效益。

A method to knock out osfwl4 to increase tiller number and yield of rice

【技术实现步骤摘要】
一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法
本专利技术属于分子生物学及基因工程
，涉及一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法。
技术介绍
水稻是重要的粮食作物，我国一半以上的人口以稻米为主食。提高水稻产量，对于确保谷物基本自给、保障国家粮食安全，具有极其重要的战略意义。分蘖数是水稻最重要的农艺性状之一，因为分蘖数直接决定每株穗数，进而影响水稻产量。水稻分蘖的发生可以分为两步：腋芽的形成和腋芽的伸长。目前，已克隆的控制腋芽形成的基因有MOC1、MOC3/TAB1、TAD1/TE、LAX1、LAX2等。MOC1是第一个被克隆的控制水稻分蘖的基因，编码一个GRAS家族转录因子，通过控制腋芽形成影响分蘖。moc1突变体只有一个主茎而不产生分蘖。独脚金内酯(Strigolactones，SLs)是一类新型的植物激素，参与调控植物分枝和根发育、与共生丛枝菌根真菌和寄生杂草互作等过程。SLs信号抑制水稻分蘖芽的伸长。催化SLs合成(如D27、D17、D10和OsMAX1)和信号转导(如D3、D14、D53、IPA1)的相关基因参与水稻分蘖的调控。其中，IPA1是一个半显性基因，编码OsSPL14转录因子，其表达受到microRNAOsmiR156的调控。该基因点突变阻碍了OsmiR156的作用，产生了分蘖数减少、抗倒伏性增强、产量增加的“理想株型”。近期研究表明，IPA1能够与D53互作，从而作为SL信号途径的下游转录因子发挥作用。尽管目前有多个控制水稻分蘖的基因被克隆，其调控机理基本阐明，但水稻分蘖调控网络中新的基因仍有待鉴定。fw2.2是番茄中控制果实大小的一个主效QTL，决定果实大小变异的30％。其对应基因FW2.2通过负调控细胞分裂影响果实大小。FW2.2同源基因在植物中广泛存在，其中，玉米ZmCNR1、PhysalisfloridanaPfCNR1、水稻OsFWL3、鳄梨Pafw2.2-like等均为细胞分裂和器官大小的负调控因子。因此，FW2.2-like(FWL)基因参与的细胞数和器官大小调控可能是植物中的一种普遍机制。水稻基因组中含有8个FWL基因，其中OsFWL3通过负调控颖壳细胞分裂影响粒长和粒重，OsFWL5/PCR1参与金属离子的运输和粒重的调控。CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9)系统是近年来新发展起来的一种新型基因组编辑技术。该系统由单导向RNA(sgRNA)和Cas9核酸酶两部分组成。利用该技术只需更换sgRNA中一段20个核苷酸的“引导序列”就可以实现对不同靶点的准确切割，避免了蛋白质工程步骤，使得构建表达单元非常简便。目前，该技术已广泛应用于包括植物在内的各种生物体基因组的定向编辑中。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，所述的方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，所述水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述的利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其具体步骤为：1)在水稻分蘖数调控基因OsFWL4的编码区选取靶标片段；2)根据靶标片段的序列信息，合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL4基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规粳稻品种，获得转基因水稻植株；4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；5)利用生物信息学工具，对靶标序列的潜在脱靶位点进行预测；然后，利用基因组引物分别对纯合或双等位T0代突变体中预测概率最高的两个脱靶位点进行PCR扩增和序列测定，获得无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体；6)对上述无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、无可检测脱靶效应、单株分蘖数和产量显著增加的水稻。优选地，步骤1)中，所述靶标片段双链结构中的一条链具有5’-(N)x-NGG-3’结构，其中，N为A、T、C、G四种碱基中任意一个，X为19或20；所述靶标片段与水稻基因组中的相似序列具有两个或两个以上的错配。优选地，步骤1)中，所述靶标片段有两个，其序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示。优选地，步骤2)中，所述sgRNA表达盒的核苷酸序列如SeqIDNo.3所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如SeqIDNo.4所示。优选地，步骤6)中，用于HPT(Hygromycinphosphotransferase)、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：HPTF：5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’，HPTR：5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’，sgRNAF：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’，sgRNAR：5’-GGCCATTTGTCTGCAGAAT-3’，Cas9F：5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’，Cas9R：5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。优选地，步骤5)中，所述生物信息学工具为CRISPR-P2.0(LiuH，DingY，ZhouY，JinW，XieK，ChenL.CRISPR-P2.0：animprovedCRISPR/Cas9toolforgenomeeditinginplants.MolecularPlant，2017，10(3)：530-532)或者CRISPR-GE(XieX，MaX，ZhuQ，ZengD，LiG，LiuY.CRISPR-GE：AconvenientsoftwaretoolkitforCRISPR-basedgenomeediting.MolecularPlant，2017，10(9)：1246-1249)。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：本专利技术提供的一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，是一种利用CRISPR/Cas9技术靶向突变OsFWL4基因获得无转基因插入突变体的方法，通过在T1代利用三对引物进行检测，可确保获得无转基因插入的突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，其特征在于，所述的方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，所述水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，其特征在于，所述的方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，所述水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其具体步骤为：
1)在水稻分蘖数调控基因OsFWL4的编码区选取靶标片段；
2)根据靶标片段的序列信息，合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL4基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；
3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规粳稻品种，获得转基因水稻植株；
4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；
5)利用生物信息学工具，对靶标序列的潜在脱靶位点进行预测；然后，利用基因组引物分别对纯合或双等位T0代突变体中预测概率最高的两个脱靶位点进行PCR扩增和序列测定，获得无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体；
6)对上述无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、无可检测脱靶效应、单株分蘖数和产量显著增...

【专利技术属性】
技术研发人员：高清松，赵祥祥，王欢欢，李刚，纪剑辉，张雯霞，崔文星，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32