一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用。所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gn1a基因的第4外显子修饰，使得第4外显子的碱基发生缺失或插入而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中第164～183位碱基，靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9对Gn1a基因的第4显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明专利技术提供的Gn1a基因基因人工定点突变体能够将水稻产量提高到20％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水稻基因组编辑育种领域，尤其涉及一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用。
技术介绍
每穗粒数是水稻最重要的农艺性状之一，是水稻产量的构成因子，直接决定水稻单产，故增加每穗粒数是水稻增产的重要途径。然而，每穗粒数是典型的数量性状，受多基因的数量性状基因位点(Quantitative Trait Loci,QTL)控制。2005年，日本名古屋大学的Matsuoka研究组利用籼粳交Habataki/Koshihikari，在第1染色体短臂上定位到一个控制粒数的QTL－Gn1。进一步利用NIL－Gn1的杂合植株(Gn1/gn1)产生的96个F2单株，将Gn1分解为两个位点：Gn1a和Gn1b，这两个位点的效应相当，Gn1a定位于R3192和C12072S之间不到2cM的区间，Gn1b位于Gn1a的上游。位于第1染色体的Gn1a基因是控制水稻每穗粒数的主效基因，可以解释籼粳品种Habataki、Koshihikari间44％的表型变异，来自籼稻品种Habataki的等位基因可以增加水稻的每穗粒数，从而可以增加水稻的单株产量。Matsuoka的研究揭示出Gn1a基因在第一外显子处出现6bp的deletion(缺失)，导致水稻产量的提高，故被育种家发现用来育种。此突变体(第一外显子6bp的缺失)为自然突变体，是随机发生的。近年来，基因组编辑技术蓬勃发展，使用基因组编辑技术CRISPR/Cas9体系对野生型的Gn1a进行人工突变，能
够获得不同于自然界突变体的新型高产突变体。
技术实现思路
利用基因组定点修饰技术CRISPR/Cas9体系，本专利技术公开了一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用。本专利技术通过对Gn1a基因的第4显子进行人工突变，影响第4显子的正常表达，导致基因功能丧失或弱化从而进一步提高水稻的产量。本专利技术的技术方案如下：一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体，所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gn1a基因的第4外显子修饰，使得第4外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入(三种突变方式可随机组合)而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中第164位碱基～第183位碱基，修饰靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第180位与181位碱基之间内插入单个碱基A，得到Gn1a基因突变体Gn1a-G1，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.1,产量提高3％左右。进一步地，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第179位造成碱基T缺失，得到Gn1a基因突变体Gn1a-G2，缺失单个碱基后的第4外显子碱基序列如SEQ ID NO.2，该突变体能将水稻产量提高10％以上。所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点位于第180位与181位碱基之间内插入单个碱基C，得到Gn1a基因突变体Gn1a-G3，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.3，该突变体能将水稻产量提高20％以上。所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第179～182位造成碱基TACT缺失，得到Gn1a基因突变体Gn1a-G4，缺失4个碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.4，该突变体能将水稻产量提高20％以上。本专利技术还提供所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体在杂交水稻育种和基因组编辑水稻育种中的应用。本专利技术机理如下：本专利技术通过针对水稻Gn1a基因，本专利技术使用CRISPR/Cas9技术在Gn1a基因的第4外显子设计靶点进行人工突变，从而人工产生不同的突变类型，然后查看这些不同类型的突变对水稻产量的影响，继而筛选出表现优异的突变类型，在第4外显子上设计靶点不易脱靶，能够得到较多的突变类型。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术采用CRISPR/Cas9对Gn1a基因的第4显子进行人工突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本专利技术提供的Gn1a基因基因人工定点突变体能够将水稻产量提高到20％以上。附图说明图1为Gn1a基因突变体Gn1a-G1第四外显子碱基序列图；图2为Gn1a基因突变体Gn1a-G2第四外显子碱基序列图；图3为Gn1a基因突变体Gn1a-G3第四外显子碱基序列图；图4为Gn1a基因突变体Gn1a-G4第四外显子碱基序列图；图5为Gn1a基因突变体Gn1a-G5第四外显子碱基序列图；图6为Gn1a基因突变体Gn1a-G6第四外显子碱基序列图；图7为野生型水稻穗粒数Gn1a基因第四外显子碱基序列图；注：图中黑色加粗区域为靶点序列，插入的碱基采用斜体表示，缺失的碱
基采用“-”表示。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细说明。实施例1水稻穗粒数Gn1a基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。Gn1a基因的第4外显子碱基序列(野生型)如SEQ ID NO.8所示，见图7本实施例CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中164位碱基～183位碱基，修饰靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。本实施例将靶点序列进行合成：Oligo15’-GGCAAAGCAGTACCTGCCTTACTA-3’，Ologo2：5’-AAACTAGTAAGGCAGGTACTGCTT-3’。本实施例使用含有cas9表达盒(35S启动子启动)和guid RNA表达盒(水稻OsU3启动子)的双元载体Pcambia1300为骨架载体进行载体构建，将靶点序列插入骨架载体中，具体做法为：将Oligo1与Oligo2进行退火磷酸化，使用限制性内切酶AarⅠ对骨架载体进行酶切，然后使用T4连接酶将退火磷酸化后的靶点序列连入骨架载体OsU3启动子与sgRNA-scaffold序列之间，完成载体构建。载体构建后，将载体转入农杆菌EHA105，以水稻中的粳稻品种日本晴作为受体进行农杆菌转化。在经过筛选，分化，生根过程后获得T0代转基因植株。采集T0代植株叶片提取DNA,在Gn1a基因第4外显子的靶点外围设计检测引物进行PCR检测，检测引物为：Gn1a-test-f:ACATGAAAAACAATGTCCGTT，Gn1a-test-r:CGTATGCACAGTACACCCAT。将PCR产物进行SANGER测序，确定发生突变的T0代植株。将在T0代检测到有突变现象的植株进行收种，进行T1代的种植，采集T1代植株叶片提取DNA，使用如上的检测引物进行检测，确定Gn1a基因突变类型为纯合突变或杂合突变；同时设计潮霉素(全写)检测引物，引物序列为：HYG-f:CTATTTCTTTGCCCTCGGAC,HYG-r:CCTGACCTATTGCATCTCCC，检测潮霉素片段的存在，以此确定外源载体T-DNA片段是否存在。筛选出6种Gn1a突变类型为纯合突变同时HYG检测为阴性的植株进行收种。将T1代筛选出的植株进行收种，进行T2代的种植，每种突变类型种植49株。理论上T2代为6种突变类型的纯合突变体。为了验证这一点，随机筛选部分植本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体，其特征在于，所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gn1a基因的第4外显子修饰，使得第4外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中第164位～第183位碱基，修饰靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。

【技术特征摘要】
1.一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体，其特征在于，所述水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对Gn1a基因的第4外显子修饰，使得第4外显子的碱基发生替换、缺失和/或插入而得到；CRISPR/Cas9修饰时修饰靶点长度为20bp，位于第4外显子中第164位～第183位碱基，修饰靶点序列为AAGCAGTACCTGCCTTACTA。2.如权利要求1所述的水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在修饰靶点第180位与181位碱基之间内插入单个碱基A，得到Gn1a基因突变体Gn1a-G1，插入碱基后的第4外显子的碱基序列如SEQ ID NO.1。3.如权利要求1所述的水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因修饰技术在修饰靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张业胜，张如，黄光福，胡凤益，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，云南大学，
类型：发明
国别省市：云南;53