一种水稻抽穗期基因载体的应用制造技术

一种水稻抽穗期基因载体的应用，它涉及水稻抽穗期基因的应用，本发明专利技术的载体用于对水稻进行改良；所述的水稻抽穗期基因载体为CRISPR/Cas9载体。本发明专利技术利用基因编辑技术对10种优质水稻品种进行抽穗期基因Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8的定点改良，经过一年的育种时间获得了纯合早熟优质改良后代。每种材料的改良后代Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8发生了不同的突变类型，导致抽穗期相对于改良前的材料至少提前5天，每种材料的种植面积至少可以北移一个积温带。

Application of rice heading stage gene vector

The invention relates to an application of a rice heading gene vector, which relates to the application of Rice Heading Date genes, and the carrier of the invention is used for improving rice, and the rice heading stage gene carrier is CRISPR/Cas9 carrier. The invention of heading date gene Hd2/OsPRR37 on 10 kinds of high quality rice varieties using gene editing technology, fixed-point modified Hd4/Ghd7 and Hd5/DTH8/Ghd8, after a year of breeding time obtained the homozygous offspring early and high quality improvement. Each kind of material modified Hd2/OsPRR37 Hd4/Ghd7 and Hd5/DTH8/Ghd8 generations, mutations in different types of lead heading relative to the modified materials before at least 5 days in advance, each kind of material can at least a planting area of North temperature zone.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻抽穗期基因载体的应用
本专利技术涉及水稻抽穗期基因的应用，尤其是10种水稻抽穗期基因的定点改良及品种北移。
技术介绍
水稻抽穗期(headingdate,HD)是指水稻从播种到抽穗(开花)所经历的时间，抽穗期是影响水稻种植和生产的最重要因素之一，它决定着水稻的种植区域和产量等其他农艺性状。黑龙江是我国优质粳稻的主产区和商品粮区，属于北方高纬度寒地稻作区，其典型地势特征南北纬度跨度大(43o25′N到53o33′N)，对水稻生长来说，可以分成4个积温带，越往北部，积温越低，因而可种植品种越少，随着世界人口增长，作为主要粮食作物的水稻种植面积急需扩大，在黑龙江省北部，有大量种植区域可以开发，那里水源充足但是霜冻来临较早，因而对于早熟优质的水稻品种的开发成为当下的重中之重。控制水稻抽穗期的基因众多，目前，已经有大量控制水稻抽穗期基因被报道，也有多个数量性状基因被克隆。但长日照条件下，控制水稻开花的基因主要有Hd1，Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7，Hd5/DTH8/Ghd8，Hd6，Hd16及Hd17，前期研究已明确Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8是控制黑龙江省水稻抽穗期的主效基因，因而可进一步通过分子辅助育种的方式，人工改造这三个主效基因及其不同组合方式，来选育适合当地的水稻品种，促进品种北移，同时扩大优良品种的种植区域。
技术实现思路
本专利技术的目的是选取优质水稻品种，进行抽穗期基因的定点改良，最终获得早熟优质水稻品种，促进品种北移扩大种植面积。本专利技术的一种水稻抽穗期基因载体的应用，它用于对水稻进行改良；所述的水稻抽穗期基因载体为CRISPR/Cas9载体。本专利技术的改良水稻品种Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8基因突变类型如图7所示。本专利技术的有益效果：本专利技术利用基因编辑技术对10种优质水稻品种进行抽穗期基因Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8的定点改良，经过一年的育种时间获得了纯合早熟优质改良后代。每种材料的改良后代Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8发生了不同的突变类型，导致抽穗期相对于改良前的材料至少提前5天，每种材料的种植面积至少可以北移一个积温带。附图说明图1为Hd2的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd2基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；图2为Hd4的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd4基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；图3为Hd5的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd5基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；图4为Hd2、Hd4和Hd5基因的五个靶点构建于pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体骨架上的示意图；图5为10种水稻品种改良前后抽穗期基因组合形式图；图6为10种水稻品种改良前后抽穗期基因的抽穗期数据变化图，以松粳9、龙稻5和龙粳20为三个积温带作为对照；图7为10种材料的改良品种Hd2、Hd4和Hd5基因序列突变类型；图8为部分品种改良前后株型差异变化图。具体实施方式通过以下试验验证本专利技术的效果：(1)基因编辑载体的构建定向选择抽穗期基因Hd2、Hd4及Hd5，利用CRISPRPrimerDesignerx86软件设计Cas9敲除载体所用打靶引物为：U3-Hd2-1-LPggcATTGATAGCGATGACTCCACCU3-Hd2-1-RPaaacGGTGGAGTCATCGCTATCAAU6c-Hd2-2-LPtcaGCATACATGCAGTGACGAAGCU6c-Hd2-2-RPaaacGCTTCGTCACTGCATGTATGU6a-Hd4-1-LPgccGGAGAAGGATGTGGCCTGTGU6a-Hd4-1-RPaaacCACAGGCCACATCCTTCTCU3-Hd4-2-LPggcAACTGGAACTCGTGCACCGGU3-Hd4-2-RPaaacCCGGTGCACGAGTTCCAGTU6b-Hd5-LPgttGTCGCCGGACTCGTTGTCCAAU6b-Hd5-RPaaacTTGGACAACGAGTCCGGCGA)，其中，U3-Hd2-1-LP、U3-Hd2-1-RP、U6c-Hd2-2-LP和U6c-Hd2-2-RP作为抽穗期基因Hd2的引物，U6a-Hd4-1-LP、U6a-Hd4-1-RP、U3-Hd4-2-LP和U3-Hd4-2-RP作为抽穗期基因Hd4的引物，U6b-Hd5-LP和U6b-Hd5-RP作为抽穗期基因Hd5的引物。订购各基因的打靶引物，载体构建步骤如下：ⅰ将100μM上下游引物各取1μL加入到98μL的0.5×TE溶液中，90℃热激30s，形成打靶接头；ⅱgRNA表达盒连接反应：取pYL-U3(pYL-U6a～c)载体采用边切边连的方式，配制体系：1μL10×T4DNAligasebuffer1μLpYL-U3-gRNA(pYL-U6a～c-gRNA)载体(10ng/μL)1μL接头(最终浓度0.1μM)35UT4DNA连接酶(0.1μL)5UBsaⅠ限制性内切酶加ddH2O至10μLPCR仪程序采用：37℃5min，20℃5min，5个循环将靶点接头连接到相应的启动子载体中；通过巢式PCR将上述PCR片段连接入CRSPR/Cas9载体骨架上：ⅲ第一轮PCR扩增(U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3；gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3)取2μL连接产物为模板，15μLPCR体系，使用引物U-F和gRNA-R各0.2μM，PrimerSTARGXL高保真PCR酶扩增；PCR程序：98℃2min，25循环：98℃10s，60℃10s，72℃20s，72℃5min；ⅳ第二轮PCR扩增B1’:5-TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3B2:5-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3B2’:5-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3B3:5-AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3B3’:5-TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3B4:5-AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3B4’:5-TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3B5:5-AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3B5’:5-TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3BL:5-AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3，取第一轮PCR产物1μL用H2O稀释20倍，取1μL为模板，使用定位引物Bn和Bn’0.15μM，PrimerSTARGXL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于它用于对水稻进行改良；所述的水稻抽穗期基因载体为CRISPR/Cas9载体。

【技术特征摘要】
1.一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于它用于对水稻进行改良；所述的水稻抽穗期基因载体为CRISPR/Cas9载体。2.根据权利要求1所述的一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于所述的对水稻进行改良按照以下步骤进行的：将CRISPR/Cas9载体通过农杆菌转化至水稻中，对获得的T0代植株提取DNA，PCR扩增Hd2、Hd4和Hd5靶点区间序列测序，对测序结果分析后，T1代植株根据T0代的突变类型，进行突变检测，选取纯合突变类型的材料继续种植，获得改良水稻，即完成所述的对水稻进行改良过程。3.根据权利要求1所述的一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于所述的CRISPR/Cas9载体构建方法为：选择水稻抽穗期基因Hd2、Hd4及Hd5，设计基因编辑载体的靶点引物，对Hd2和Hd4各设计两个靶点，对Hd5设计一个靶点，通过gRNA表达盒，将这五个靶点连接到gRNA上，再通过巢式PCR获得基因片段，最终将这些片段连接入CRSPR/Cas9载体骨架上，即完成所述的CRISPR/Cas9载体构建。4.根据权利要求3所述的一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于所述的设计基因编辑载体的靶点引物具体为：5.根据权利要求3所述的一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于所述的通过gRNA表达盒，将这五个靶点连接到gRNA上，具体操作如下：取pYL-U3-gRNA载体，采用如下体系和程序，采用边切边连的方式，将五个靶点连接到gRNA上，其中，体系为10μL，如下：PCR程序为：37℃5min，20℃5min，5个循环。6.根据权利要求3所述的一种水稻抽穗期基因载体的应用，其特征在于所述的巢式PCR反应程序如下：第一轮PCR扩增取2μL连接产物为模板，15μLPCR体系，使用引物U-F和gRNA-R，PrimerSTARGXL高保真PCR酶扩增；PCR程序：98℃2min，25循环：98℃10s，60℃10s，72℃20s，72℃5min；第二轮PCR扩增取第一轮PCR产物1μL用H2O稀释20倍，取1μL为模板，使用定位引物Bn和Bn’，PrimerSTARGXL高保真PCR酶扩增；程序：98℃2min，25循环：98℃10s，60℃10s，72℃30s，72℃5min。7.根据权利要求6所述的一种水稻抽...

【专利技术属性】
技术研发人员：卜庆云，李秀峰，林精波，方军，王臻昱，
申请(专利权)人：中国科学院东北地理与农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23