一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体设计一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其应用。从森林草莓中筛选得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段，构建得到该基因的植物抑制表达载体GN2300‑FveHK4，转入二倍体森林草莓‘Hawaii 4’中，获得FveHK4基因的RNAi表达干扰株系，该株系的营养生长与野生型没有明显差异。在黑暗条件下，FveHK4‑RNAi离体叶片的衰老与野生型相比明显延缓，表明遗传转化FveHK4干扰载体的森林草莓转基因株系叶片衰老速度变缓，功能期延长。本发明专利技术对延缓草莓叶片衰老，提高叶片的光合生产量进而提高草莓产量具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种延缓森林草莓叶片衰老的载体及其制备方法和应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种延缓草莓叶片衰老的载体及其应用。
技术介绍
作物叶片是植物进行光合作用的重要场所,也是植物衰老最敏感的器官之一。叶片衰老是导致叶片自然死亡的生命活动衰退的过程，在形态上表现为黄化。植物叶片颜色的变化能够反映出叶片的衰老状况和叶绿素的损失，叶绿素逐渐丧失而呈现黄色是叶片衰老最明显的特点。叶片衰老对作物的产量和质量有重要影响。有研究报道，在玉米、水稻等作物叶片上喷施适宜浓度的细胞分裂素类物质，可以延缓叶片衰老、改善作物品质，有明显的增产效果。细胞分裂素是植物的生长调节因子，参与植物生长发育的各个过程，对植物形态建成和农作物产量有着重要意义。生产上常用的细胞分裂素主要有6-苄氨基嘌呤、激动素、玉米素等。细胞分裂素对植物生长发育最明显的生理作用是促进细胞分裂、调控器官分化、延缓蛋白质和叶绿素的降解、延迟衰老等。因此，通过调控细胞分裂素相关基因的表达，有可能延缓叶片衰老，为挖掘叶片的光合生产潜力提供可能的途径。草莓(Fragaria×ananazsaDuch.)是蔷薇科草莓属多年生草本植物，其果实甜美可口，富含营养物质，具有较高的经济价值。延缓草莓叶片衰老、延长其叶片功能期对提高草莓叶片的光合生产量进而提高草莓产量具有重要的意义。然而，目前对草莓叶片衰老机制的研究很少，尚没有其叶片衰老延缓基因的报道。栽培草莓是八倍体，遗传背景复杂。森林草莓(Fragariavesca)是栽培草莓的直系祖先，与栽培草莓在营养生长和生殖生长方面的特性基本相同，但具有生长周期短、转化体系成熟、基因组小的优势，由此是研究栽培草莓的理想模式植物。调控森林草莓基因的表达实现其叶片衰老的延缓对延长栽培草莓叶片功能期，进而提高草莓产量具有重要的参考价值。
技术实现思路
针对现有技术中的亟需延缓草莓叶片衰老的问题，本专利技术的目的在于提供一个森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体。本专利技术所构建的植物抑制表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，对延缓草莓叶片衰老及延长叶片的功能期、充分挖掘叶片的光合生产潜力最终取得高产具有重要的意义。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段在延缓草莓叶片衰老中的应用，所述RNA干扰片段核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAGTTGTGGTGATGGGTGGGAATTTGAAGATGCAGAGCCACCACTCTGTGGCTGTGAGGTTGAATGAGCAAATGGGGGCCAAAAAGGGCTTCACTTTTATTCAGGCTTACAGAGCTTGGTTCCCAAAGCTTTTGATGCTTTGGATTCTGGTGATGGCTTATTTGAGCTTCTCAATCTACAATTACATGGATGCTGATAACAAAGTG(SEQIDNO.1)。进一步的，所述RNA干扰片段核苷酸序列为位于NCBI登录号为XM_004297360的FveHK4序列675～899bp区域。本专利技术从森林草莓中鉴定得到一个细胞分裂素受体基因FveHK4。本专利技术的FveHK4的RNA干扰片段是FveHK4基因序列中675～899bp区域长度为225bp的片段，同时也是与其他细胞分裂素受体基因以及其他草莓基因特异的一段序列。本专利技术的第二个目的是提供一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中插入森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的ihpRNA发夹结构所得到，所述ihpRNA发夹结构由森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链(SEQIDNO.1所示)-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链构成。进一步的，所述植物抑制表达载体GN2300-FveHK4中ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAGTTGTGGTGATGGGTGGGAATTTGAAGATGCAGAGCCACCACTCTGTGGCTGTGAGGTTGAATGAGCAAATGGGGGCCAAAAAGGGCTTCACTTTTATTCAGGCTTACAGAGCTTGGTTCCCAAAGCTTTTGATGCTTTGGATTCTGGTGATGGCTTATTTGAGCTTCTCAATCTACAATTACATGGATGCTGATAACAAAGTGttcgaccatattattcaggtacattctgatttcattatcttcctacttggttaaatttcaacatgtaatactatttttggcttcaaacatttaaattaaggatgtgtactttaatgtgatgcagcttgcaaagcTctagtCACTTTGTTATCAGCATCCATGTAATTGTAGATTGAGAAGCTCAAATAAGCCATCACCAGAATCCAAAGCATCAAAAGCTTTGGGAACCAAGCTCTGTAAGCCTGAATAAAAGTGAAGCCCTTTTTGGCCCCCATTTGCTCATTCAACCTCACAGCCACAGAGTGGTGGCTCTGCATCTTCAAATTCCCACCCATCACCACAACTTCAACTACCTCTTTGCTTCT(SEQIDNO.2)。本专利技术的第三个目的是提供一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：S1：获得森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段：S1-1：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物FveHK4-RNAi-F1：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQIDNo.4)和FveHK4-RNAi-R1：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQIDNo.5)，扩增得到SEQIDNO.1所示的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链；S1-2：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物FveHK4-RNAi-F2：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQIDNo.6)和FveHK4-RNAi-R2：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQIDNo.7)，扩增得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链；S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物Intron-F：5'-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段在延缓草莓叶片衰老中的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段在延缓草莓叶片衰老中的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段核苷酸序列位于NCBI登录号为XM_004297360的FveHK4序列675～899bp区域。


3.一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，其特征在于，所述植物抑制表达载体为在GN2300通用载体的XbaI/SalI双酶切位点中插入森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的ihpRNA发夹结构所得到，所述ihpRNA发夹结构由森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链(SEQIDNO.1所示)-内含子-森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链构成。


4.根据权利要求3所述的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4，其特征在于，所述ihpRNA发夹结构的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.一种森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的植物抑制表达载体GN2300-FveHK4的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1：获得森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段：
S1-1：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F1：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQIDNo.4)和
FveHK4-RNAi-R1：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQIDNo.5)，扩增得到SEQIDNO.1所示的森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的正义链；
S1-2：根据NCBI数据库登录号：XM_004297360公布的FveHK4序列为模板，设计特异性引物
FveHK4-RNAi-F2：5'-CACTTTGTTATCAGCATCCATG-3'(SEQIDNo.6)和
FveHK4-RNAi-R2：5'-AGAAGCAAAGAGGTAGTTGAAG-3'(SEQIDNo.7)，扩增得到森林草莓细胞分裂素受体基因FveHK4的RNA干扰片段的反义链；
S2：获得内含子片段：以NCBI登录号：LOC101294385的序列为模板，设计特异性引物
Intron-F：5'-GGACTCTGCAGGTCGACCATATTATTCAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁静，咸志慧，王永，李义，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32