人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。包括如下步骤：引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析。为了能够灵敏的检测到微量的ATIII基因，本研究建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR检测人ATIIII基因的技术方法，最低能检测到1copy的ATIII基因，并且检测特异性高。在此基础上，开展了抗凝血酶III转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII基因的检测工作(共57个样本)，结果表明人ATIII基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移，提示转基因羊对于环境是安全的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于对转基因动物环境安全的检测和评价领域，具体涉及一种人抗凝血酶 III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。
技术介绍
随着生物技术的快速发展，转基因动物研究的不断深入和加快，转基因育种成为培养新品种的重要途径，商业化转基因动物即将面世的同时，与转基因相伴而生的潜在的安全问题已引起世界各国的关注和重视。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信息发生了转移、替换、融合和表达的遗传工程体，由于外源基因的插入，打破了原有的育种规律，改变了物种多样性局面，可能发生潜在的生物环境安全问题，造成重大经济损失， 对人类生存造成威胁。因此，对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生态环境安全、促进转基因动物相关技术的快速健康发展。基因漂移是指转基因生物中转入的外来基因，转移到相邻的其他生物之中，从而改变其他生物的基因组成。转基因植物发生基因漂移可能引起的生态环境安全性问题已经引起广泛关注，而转基因动物发生基因漂移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因动物发生基因漂移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。本研究建立了实时荧光定量PCR技术检测抗凝血酶III的技术方法，并充分发挥了申请人青岛森淼实业有限公司的转基因羊资源优势M，开展抗凝血酶III (ATIII)转基因羊环境安全性评估的初步研究。
技术实现思路
本专利技术采用如下技术方案实施研究一种人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤引物及Taqman探针设计，血液基因组DNA的制备，ATIII基因的扩增，ATIII基因的克隆，荧光定量PCR检测和敏感性评价及定量分析；其中，(1)引物及Taqman探针设计①利用Primer Primer 5. 0软件分析人ATIII基因的序列NM_000488，设计并合成用于构建标准质粒的人ATIII特异性引物F5’ -gtgataggaactgtaacct-3' ；R 5' -cggccagcaatcacaacag-3',②利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3. 0 软件设计 Taqman 探针和引物F 5 ’ -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3’，R 5，-GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3，，Taqman 探针5，-(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3，，③利用BLAST在线软件分析设计引物和探针序列的特异性；(2)血液基因组DNA的制备血样采用EDTA抗凝，血液置于1. 5ml离心管中4°C保存备用；利用QIAGEN离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组；(3)ATIII基因的扩增①以编号A22的转ATIII基因羊血液基因组为模板；②PCR扩增体系如下DNA模板 10ng，IOXEx Taq bufer 2· 5μ l，dNTP 2. 5mM 5μ1，引物F IOpM ，引物 R IOpM ，Taq 酶 0. 2 μ 1，ddH20 补至Ij 25 μ 1。反应条件为 94°C 5min ;95°C 30S，55°C 30S， 72°C 1. 5min，25个循环；72°C IOmin ；扩增片段大小为1263bp,以琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收；G)ATIII基因的克隆利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将ATIII基因PCR扩增产物回收，胶回收产物连接到PMD18T载体中，转化E.coli DH5 α，挑取单克隆，PCR鉴定，并测序鉴定；(5)质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定260nm与280nm波长下的OD值，计算DNA浓度并判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数；(6)荧光定量PCR检测；(7)敏感性评价及定量分析；(8)特异性评价上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是①制备质粒标准品；标准品作10倍梯度稀释，_20°C保存备用；②样品质粒用紫外分光光度计测定^Onm与^Onm波长下的OD值，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数每微升质粒拷贝数=(质量/ 分子量)X (6. 02 X IO23)= X 10_9/2404697 ]X (6. 02 X IO23个/mol)，其中6. 02 X IO23是阿佛加德罗常数；2404697是标准质粒的分子Mo上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的荧光定量PCR检测的方法是上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的敏感性评价及定量分析的方法是25 μ 1 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液 12. 5 μ 1，血样 DNA模板10ng，引物为300nM、探针为250nM，体系用ddH20补齐；特异性反应条件为二温循环，即95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin, 40个循环；用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的敏感性评价及定量分析的方法是RNA标准品经1/10系列稀释，利用建立的检测体系对不同浓度的RNA标准品进行荧光定量PCR检测，以确定检测灵敏度；同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线，对检测样品进行定量分析。上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的特异性评价的方法是利用建立的检测体系对编号为A22的转人ATIII基因羊血液基因组，非转基因羊血液基因组，和其它对照动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证其特异性；上述的人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是所述的采取动物血液基因组样品的方法是采用颈静脉取血的方法分别采集转ATIII基因羊血液基因组血液样品，转乙肝表面抗原基因羊血液样品，转干扰素转基因羊血液样品，野生型山羊血液样品，家养犬静脉血液样品，试验用小鼠静脉血液样品；以及采用翅静脉采血法采取家养鸡血液样品和家养鹅血液样品；建立上述各动物血液基因组，进行荧光定量PCR检测，以验证人抗凝血酶III转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法的特异性。本专利技术的优点本专利技术的技术方案建立了灵敏、特异的实时荧光定量PCR检测人ATIII基因的技术方法，最低能检测到Icopy的ATIII基因，并且检测特异性高。在此基础上，开展了抗凝血酶III转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与ATIII转基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中ATIII基因的检测工作(共57 个样本)。结果表明人ATIII基因没有在转基因羊和非转基因羊及其它动物间发生漂移，提示转基因羊对于环境是安全的。附图说明图1是实施例2的PCR克隆人ATIII基因片段示意图；图2是实施例3的荧光定量PCR检测ATIII标准质粒(1到1 X IO9Copy/ μ 1)的扩增曲线示意图；图3是实施例3的定量PCR检测ATIII的标准曲线示意图；图4是实施例3的定量PCR的特异性试验示意图；Α、转ATIII基因羊血液基因组为模板；B、以非转基因羊和小鼠血液基因组为模板；图本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种人抗凝血酶ＩＩＩ转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法，其特征是包括如下步骤：引物及Ｔａｑｍａｎ探针设计，血液基因组ＤＮＡ的制备，ＡＴＩＩＩ基因的扩增，ＡＴＩＩＩ基因的克隆，荧光定量ＰＣＲ检测和敏感性评价及定量分析；其中，（１）引物及Ｔａｑｍａｎ探针设计①利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件分析人ＡＴＩＩＩ基因的序列ＮＭ＿０００４８８，设计并合成用于构建标准质粒的人ＡＴＩＩＩ特异性引物Ｆ５’－ｇｔｇａｔａｇｇａａｃｔｇｔａａｃｃｔ－３’；Ｒ：５’－ｃｇｇｃｃａｇｃａａｔｃａｃａａｃａｇ－３’，②利用Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司的Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０软件设计Ｔａｑｍａｎ探针和引物Ｆ：５’－ＴＧＴＧＡＴＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＡＣＣＴＣＴＧＧ－３’，Ｒ：５’－ＧＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣ－３’，Ｔａｑｍａｎ探针５’－（ＦＡＭ）ＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）－３’，③利用ＢＬＡＳＴ在线软件分析设计引物和探针序列的特异性；（２）血液基因组ＤＮＡ的制备血样采用ＥＤＴＡ抗凝，血液置于１．５ｍｌ离心管中４℃保存备用；利用ＱＩＡＧＥＮ离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组；（３）ＡＴＩＩＩ基因的扩增①以编号Ａ２２的转ＡＴＩＩＩ基因羊血液基因组为模板；②ＰＣＲ扩增体系如下：ＤＮＡ模板１０ｎｇ，１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｅｒ ２．５μｌ，ｄＮＴＰ ２．５ｍＭ ５μｌ，引物Ｆ １０ｐＭ，引物Ｒ １０ｐＭ，Ｔａｑ酶０．２μｌ，ｄｄＨ２Ｏ补到２５μｌ。反应条件为９４℃５ｍｉｎ；９５℃３０Ｓ，５５℃３０Ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，２５个循环；７２℃１０ｍｉｎ；扩增片段大小为１２６３ｂｐ，以１％琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果并回收；（４）ＡＴＩＩＩ基因的克隆利用ＤＮＡ琼脂糖凝胶回收试剂盒将ＡＴＩＩＩ基因ＰＣＲ扩增产物回收，胶回收产物连接到ｐＭＤ１８Ｔ载体中，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α，挑取单克隆，ＰＣＲ鉴定，并测序鉴定；（５）质粒标准品浓度的计算将上述质粒用紫外分光光度计测定２６０ｎｍ与２８０ｎｍ波长下的ＯＤ值，判断其纯度，然后转换成质粒的拷贝数；（６）荧光定量ＰＣＲ检测；（７）敏感性评价及定量分析；（８）特异性评价。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁三平，顾玉超，邹贤刚，赵雅琳，
申请(专利权)人：青岛森淼实业有限公司，
类型：发明
国别省市：95
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。