一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88 FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法。本发明专利技术的抗产毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体由抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过短的连接肽连接而成。轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。获得的抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体分子量约为28kDa，能够特异性的识别产肠毒素大肠杆菌K88，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌K88的感染和粘附。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体及其制备方法，属于基因工程

技术介绍
断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrhea，PWD)发生在仔猪断奶时或断奶后的第1周，临床上主要症状表现为腹泻、脱水、生长缓慢或停止生长，从而引起仔猪的大量死亡，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。超过50％断奶仔猪腹泻病例中是由特定血清型的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)造成的。目前细菌耐药性问题越来越严重，抗生素治疗细菌感染效果不理想。单链抗体是一种基因工程抗体，以其分子量小、特异性高、穿透力强、易于改造等特点，显示了巨大的应用潜力，越来越受到人们的重视。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的基因工程单链抗体及其制备方法。本专利技术的单链抗体能够与产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白特异性结合，可用于阻断产肠毒素大肠杆菌的感染和粘附。本专利技术的技术方案具体介绍如下。本专利技术提供一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体，所述单链抗体具有如SEQ ID No：1所示重链可变区VH的氨基酸序列、如SEQ ID No：2所示的轻链可变区VL氨基酸序列和位于重链可变区VH和轻链可变区VL之间的连接肽。优选的，所述连接肽的序列为：GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。优选的，所述单链抗体具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。本专利技术还提供一种编码上述单链抗体的基因，其具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。优选的，所述核苷酸序列中包含内切酶位点SfiI、NotI，其中SfiI的序列为GGCCNNNNNGGCC，NotI的序列为GCGGCCGC。本专利技术进一步提供一种上述单链抗体的表达载体。优选的，其为原核表达载体。更优选的，所述原核表达载体为pCANTAB-5e-ScFv载体。更进一步的，本专利技术提供一种上述单链抗体的制备方法，具体步骤如下：(1)采用RT-PCR直接从产肠毒素大肠杆菌K88感染的猪外周血RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因；(2)利用SOE-PCR法将连接序列linker与重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因相连构建猪源性单链抗体基因；(3)将步骤(2)的猪源性单链抗体基因克隆到噬菌体抗体展示载体pCANTAB5e中，构建重组噬菌粒pCANTAB5e-ScFv；(4)将步骤(3)的重组噬菌粒载体pCANTAB5e-ScFv电转化入E.coli TG1感受态细胞，获得猪源性噬菌体单链抗体库；(5)将步骤(4)获得的猪源性噬菌体单链抗体库用以原核表达的产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白作为包被抗原进行噬菌体ELISA，得到的阳性克隆即为含有抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG的单链抗体；(6)分离纯化步骤(5)所得阳性克隆培养产物即获得猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88蛋白的单链抗体。需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本专利技术各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本专利技术所陈述的发法准确获得.本专利技术的技术原理是采用RT-PCR直接从产肠毒素大肠杆菌K88感染的猪外周血RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将连接序列linker与VH基因和VL基因相连构建猪源性单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5e中，phage-ELISA筛选抗ETEC单链抗体的阳性克隆，测序后使用DNAstar的Megalin进行序列分析，证明该单链抗体属于猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88蛋白的单链抗体。本专利技术的有益效果是：抗猪产肠毒素大肠杆菌K88的基因工程抗体能与猪产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白特异性结合，能够用于猪产肠毒素大肠杆菌病K88的粘附阻断及其功能验证。附图说明图1为RT-PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VH基因RT-PCR产物。图2为RT-PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VL基因RT-PCR产物。图3为VH-Linker-VL PCR电泳图；M为2000bp DNA ladder marker；1为VH-Linker-VL基因PCR产物。图4为pCANTAB5e-ScFv双酶切鉴定；M为2000bp DNA ladder marker；1、2为重组 质粒经Sfi I和Not I双酶切。图5为重组原核表达载体pCANTAB5e-ScFv质粒图谱。图6为噬菌体抗体库的多样性分析。图7为抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG单链抗体的纯化电泳图；M为预染蛋白Marker；1为纯化后的单链抗体。具体实施方式实施例1猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体的制备1、对GenBank已公布的猪抗体编码基因重链可变区序列(AF064686.1；AF064687.1；AF064688.1；AF064689.1；AF064690.1)和轻链可变区序列(KF561242.1；GQ867594.1；GQ867595.1)设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH1F分别与VH1R、VH2R用于扩增VH区；VL1F、VL2F、VL3F和VL1R用于扩增VL区；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F扩增的VL基因基础上加入酶切位点，VL2R用于VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位点，VL 2R含有Not I酶切位点；VH3R、VL4F、VL5F、VL6F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。Linker采用(GGGGS)3，其对应的编码核苷酸序列为：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小注：下划线代表Sfi I或Not I酶切位点，方框代表连接肽序列。2、VH和VL基因的扩增以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因(见图1)。引物VL1F、VL2F、VL3F分别与引物VL1R配对，扩增VL基因(见图2)。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix 12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH2O 8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据Thermo公司提供的胶回收说明书操作)。3、ScFv基因的获得分别以VH和VL基因为模板，VH2F、VH2R为引物PCR扩增带有Linker的重链可变区基因，VH4F、VL5F、VL 6F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No：1所示的重链可变区VH氨基酸序列，如SEQ ID No：2所示的轻链可变区VL氨基酸序列和位于重链可变区VH和轻链可变区VL之间的连接肽。

【技术特征摘要】
1.一种猪源性抗产肠毒素大肠杆菌K88FaeG蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID No：1所示的重链可变区VH氨基酸序列，如SEQ ID No：2所示的轻链可变区VL氨基酸序列和位于重链可变区VH和轻链可变区VL之间的连接肽。2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述连接肽的序列为：GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。3.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，该单链抗体具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。4.一种编码权利要求1-3之一所述的单链抗体的基因，其特征在于，其具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列中包含内切酶位点SfiI、NotI，其中SfiI的序列为GGCCNNNNNGGCC，NotI的序列为GCGGCCGC。6.一种权利要求1-3之一所述的单链抗体的表达载体。7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，其为原核表达载体。8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述原核...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，张凡庆，王苗苗，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31