一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法技术

本发明专利技术公开一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L-苯丙氨酸，所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成。本发明专利技术可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高，有害副产物乙酸浓度低，发酵成本低廉，工艺简单，适宜产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种通过基因工程技术和发酵的手段增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。
技术介绍
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是一种人体必需但自身无法合成的具有生理活性的芳香族氨基酸，也是一种重要的医药和食用化学品中间体，在医药行业主要用于生产抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂，在食品行业主要用于合成二肽甜味剂阿斯巴甜，具有良好的应用前景。生产L-苯丙氨酸的方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法四种，其中，微生物发酵法所利用原料廉价易得，又可在常温常压下进行，是目前国内外生产L-苯丙氨酸的主流方法。L-苯丙氨酸在大肠杆菌细胞内通过芳香族氨基酸合成代谢途径合成:葡萄糖进入细胞后经过糖酵解途径和磷酸戊糖途径合成磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤藓糖，在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(AroG)的作用下进入莽草酸途径，在莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)等酶类的作用下合成分支酸，之后经分支酸变位元酶和预苯酸脱水酶(PheA)等酶作用生成芳香族氨基酸前体物，再经过酪氨酸转氨酶(TyrB)的作用合成L-苯丙氨酸。从自然界中筛选出的具有产酸能力的微生物菌株一般氨基酸积累量有限；通过特别修饰选育出的突变株虽可提高L-苯丙氨酸的生产效率，但其盲目性大，工作量繁重，生产成本高，且突变株一般携带有营养缺陷，产量进一步提高受到限制。通过基因克隆手段解除代谢调控位点以促进目的产物合成已成功应用于柠檬酸、乳酸、琥珀酸等多种代谢产物的发酵生产，是L-苯丙氨酸工业化生产的必然趋势，但是，L-苯丙氨酸的代谢调控受限于基因转录起始、转录过程、翻译起始、翻译过程、酶量、酶活等多水平、不同层次的反馈控制，且由于质粒载体的大小受到限制，很难通过过量表达连续的多个基因来解除所有的调控位点，此外，大肠杆菌在发酵过程中会积累副产物一乙酸，其可限制菌体的生长及目的产物的合成，降低产率。总之，可高产L-苯丙氨酸且发酵成本低廉的基因工程菌株目前尚未见报道，难以形成产业化。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。本专利技术可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高，有害副产物乙酸浓度低，发酵成本低廉，工艺简单，适宜产业化生产。本专利技术的技术方案如下:一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸_7_磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA 、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌,并通过液体发酵生产L-苯丙氨酸。其进一步的技术方案为:所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成；所述液体发酵条件控制如下:发酵培养基的起始葡萄糖浓度为3 15g/L，发酵过程中的葡萄糖浓度为I 4g/L ;发酵温度35 42°C，发酵pH值6.5 7.5，通气量0.5 1.0vvm，溶氧量为初始氧浓度的10 35%，发酵时间48 72h。所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因的天然启动子被其它不受末端代谢产物反馈阻遏的强启动子所替换，以增强其表达水平。所述TyrB编码基因编码框的起始碱基序列被SEQ ID NO:1所示的碱基序列替换，以解除其与阻遏蛋白TyrR的结合能力。所述AroG氨基酸序列中第146位的天门冬氨酸被替换成天门冬酰胺，以解除苯丙氨酸对其的反馈抑制。所述PheA的R-domain结构域被删除，以解除苯丙氨酸对其的反馈抑制。所述强启动子包括Pk和/或Plj启动子本专利技术的有益技术效果如下:本专利技术运用基因工程手段将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰，如引入强启动子、删除结构域、碱基替换、氨基酸突变等，使上述基因所受的代谢调控得到解除，再插入载体成功构建得到可同时过量表达TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以 及YdiB的表达质粒,转化该质粒的宿主大肠杆菌可高产L-苯丙氨酸；其中，通过增强L-苯丙氨酸合成代谢通路所需酶类(AroG、PheA、AroK、YdiB以及TyrB)的表达水平，可加快L-苯丙氨酸的合成速率，同时，YddG的表达增强可加快L-苯丙氨酸的胞外转运速率，降低胞内浓度，从而降低L-苯丙氨酸对代谢合成途径产生的反馈抑制，最终达到提高其代谢通量和发酵强度的目的；本专利技术方法可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高(可达62g/L)，有害副产物乙酸浓度低(< 3g/L)，发酵成本低廉，工艺简单，适宜产业化生产。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术进行具体说明。以下实施例所涉及试验材料如下:大肠杆菌拟合DNA提取自大肠杆菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 (购自美国模式菌种收集中心ATCC，保藏编号为ATCC NO:27325) ；pMD 18T_simpleVector购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶EcoR 1、EcoRV、Afl I1、Nco1、Kpn I，DNA聚合酶，连接酶均购自赛默飞公司；质粒pSY130-14 (包含Pl启动子)由本专利技术人实验室保藏，其构建方法可参照如下文献报道:S Sugimoto, M Yabuta, NKato,T Seki,T Yoshida, H Taguchi(1987)Hyperproduction of phenylalanine byEscherichia col1:application of a temperature-controllable expression vectorcarrying the repressor-promoter system of bacteriophage lambda.Journal ofBiotechnology.5:237 - 253 ；RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(离心柱型含DNAase)购自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time购自宝生物工程(大连)有限公司。其它原料和试剂为市售国产或进口分析纯商品。所使用仪器设备均为本领域常规仪器设备。以下实施例所用种子培养基为LB培养基，其组成为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，其余成分为水；所用液体发酵培养基组成为=K2HPO4.3H20 13.57g/L, KH2PO4 4.5g/L, (NH)4SO2 lg/L, MgSO4 lg/L, arginine0.lg/L, histidine 0.lg/L,isolecine 0.lg/L, valine 0.lg/L, proline 0.2g/L, p-aminobenzoic acid 0.02g/L, p-hydroxybenzoic0.02g/L, CaCl2 0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强大肠杆菌L?苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于：将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3?脱氧?D?阿拉伯庚酮糖酸?7?磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L?苯丙氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘双平，石贵阳，张梁，丁重阳，何冬旭，李赢，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：