一种苷元型大豆异黄酮的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种苷元型大豆异黄酮的制备方法。该方法使用依赖热丝菌Thermofilum?pendens?beta-葡萄糖苷酶、在高温含水的二甲基亚砜中、水解大豆异黄酮糖苷的糖苷键，制备大豆异黄酮苷元。首次建立了将总糖苷含量在40％(w/w)以上的糖苷型大豆异黄酮全部体外酶解转化为苷元型大豆异黄酮的方法，具有反应液体积小，反应速度快，酶解效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其是指利用一种极端热稳定、耐有机溶剂的beta-葡萄糖苷酶、在高温含水的有机溶剂中、水解大豆异黄酮糖苷的糖苷键，制备苷元型大豆异黄酮。
技术介绍
大豆异黄酮对人体具有较弱的雌激素活性，可以缓解妇女更年期不适症、预防骨质疏松症、降低乳腺癌和前列腺癌等肿瘤疾病的发生率。目前，大豆异黄酮类保健食品已被广泛用于雌激素替代疗法，以补充绝经期女性体内的雌激素。大豆异黄酮有糖苷型和苷元型二种分子结构形式。苷元型大豆异黄酮在人体内的生物利用度较高，他能够直接被人体肠道吸收进入血液，血药浓度高、峰值时间短。糖苷型大豆异黄酮的生物利用度较低，他不能被人体肠道直接吸收，只有少部分在肠道菌群分泌酶的作用下，被水解下葡萄糖残基，转变成苷元形式，才能被吸收。大豆及其醇提物中的异黄酮主要是糖苷型。为了提高大豆异黄酮的口服吸收率，常常使用beta-葡萄糖苷酶预先在体外将低大豆异黄酮糖苷含量的醇提物转化为大豆异黄酮苷元。然而大豆异黄酮的水溶性较低(例如在室温下，染料木苷的水溶性小于25 μ M)，至今仍不能直接酶法转化大豆异黄酮糖苷含量在40% (w/w)以上的醇提物
技术实现思路
本专利技术采用嗜热古细菌beta-葡萄糖苷酶，在高温和含水的有机溶剂中催化高浓度的糖苷型大豆异黄酮水解，从而制备苷元型大豆异黄酮(图1)。本项专利技术所使用的大豆异黄酮糖苷，包括染料木苷(genistin)、大豆黄苷(daidzin)、黄豆黄苷(glycitin)及其混合物,总糖苷含量在40% (w/w)以上。本项专利技术所使用的有机溶剂是二甲基亚砜；二甲基亚砜能与水互溶，并且大豆异黄酮在含水的二甲基亚砜里具有较高的溶解度。本项专利技术所使用的极端热稳定、耐有机溶剂的beta-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21),属于碳水化合物活性酶GH3家族，产自含有外源依赖热丝菌Thermof i Ium pendensbeta-葡萄糖苷酶基因(Tpbgl)的大肠杆菌。即采用常规的基因克隆法(Sambrook andRusse11,Molucular Cloning:A Laboratory Manual,third edition.Cold Spring HarborLaboratory Press.2001.1SBN 978-087969577-4):以 IyL 依赖热丝菌 Thermofilumpendens基因组DNA为模版(IOng)，加入8 μ L四种dNTP混合物(每种2.5mM)、2 μ LX 10 μ M正向引物(Tpbgl-NdeI:5 ' -GGGCATATGAGGGGAAGGGGCCCTG-3 ' )、2μ Χ10μΜ 反向引物(Tpbgl-HindI II:5/ -CCGAAGCTTTCAGGGCGCGAATCTCA-3 ' )、20 μ L 缓冲液(5><PrimeSTAR buffer Mg2+p I us) >66 μ L 无菌蒸懼水和 I μ LDNA 聚合酶(PrimeSTAR HS DNA polymerase,2.5U/ μ L)，在变性温度98°C、退火温度62°C、延伸温度72°C的条件下，进行聚合酶链式反应，扩增出2.1kb的Tpbgl基因；将以限制性内切酶NdeI和HindIII分别双消化的Tpbgl基因和p6 X His119载体混和，加入T4DNA联接酶，构建重组质粒p6 X His119-Tpbgl，然后转化大肠杆菌 E.coli MC1061 ;基因重组大肠杆菌的培养、beta-葡萄糖苷酶的制备、纯化和活性测定的方法为文献“Choi,K1-Won et al.Modulation of the Regioselectivity of aThermotoga neapolitana β -Glucosidase by Site-Directed Mutagenesis.Journal ofMicrobiology and Biotechnology.2008,18 (5):901_907” 中所报道的方法。米用上述方法所得到的依赖热丝菌Thermofilum pendens beta-葡萄糖苷酶,是一种新型的基因重组嗜热古细菌beta-葡萄糖苷酶；此酶水解对硝基苯-D-批喃葡糖苷的最适催化反应温度是90°C、最适催化反应pH是3.5 ;并且，在10-60% (v/v)的二甲基亚砜中，仍具有较高的水解活性。由于高温和含水的二甲基亚砜有助于增强大豆异黄酮糖苷的溶解度，所以在依赖热丝菌Thermofilum pendens beta-葡萄糖苷酶催化的水解反应中，可以使用较高底物浓度的大豆异黄酮糖苷。本专利技术所涉及的苷元型大豆异黄酮的制备方法，包括以下步骤:(I)将总糖苷含量在40% (w/w)以上的大豆异黄酮，加入到浓度为10-60% (v/v)的二甲基亚砜(含PH值为3-7的缓冲液)中，混匀，使底物的浓度为0.05-0.55% (w/v)；(2)将上述底物溶液在50-100°C预热3min-lhr ；⑶加入酶活力为IO-5OOlVmL反应液的依赖热丝菌Thermofilum pendensbeta-葡萄糖苷酶,混勻；(4)继续在50-100°C保温10min-2hr，然后冷却至室温；(5)通过活化的碳十八柱或大孔吸附树脂柱，吸附异黄酮、再水洗除糖盐、最后以70%乙醇(v/v)解析异黄酮。本专利技术所涉及 的碳十八柱或大孔吸附树脂柱的活化，是采用70%乙醇(v/v)过夜浸泡后，再水洗除醇；然后将反应液上柱、吸附异黄酮；再以二柱体积水洗除糖盐、以二柱体积70%乙醇(v/v)解析异黄酮；流速均为一小时二柱体积。大孔吸附树脂可以选用Rohm&Haas Amberlite XAD16大孔吸附树脂或其他极性相近的大孔吸附树脂。本专利技术所涉及的大豆异黄酮的检测方法为高效液相色谱法，检测条件为:采用高效液相色谱(Prominence LC 20AT,岛津，日本)；紫外检测器，波长254nm ；色谱柱，碳十八(Zorbax Eclipse XDB, 150 X 4.6mm 1.d., 3.5 μ m particle size,安捷伦，美国)；流动相，A:甲醇/水/甲酸(20: 80: 0.1)和B:甲醇/水/甲酸(80: 20: 0.1)；洗脱梯度=Omin, 100% A:0 30min，B由零线性增加到100%;流速0.8mL/min ;柱温25。。;进样体积20 μ L。由于使用了这种新型的beta-葡萄糖苷酶，所以能够在含水有机溶剂中于较高的温度下，进行高浓度底物的酶法水解反应，可以使大豆异黄酮糖苷全部转化为相应的大豆异黄酮苷元，缩小了反应液的体积，提高了酶解效率，具有较好的应用价值。附图说明图1是染料木苷高效液相色谱图。图中保留时间为15.13Imin的色谱峰为染料木苷。图2是加入依赖热丝菌Thermofilum pendens beta-葡萄糖苷酶后,染料木苷完全被水解为染料木素的高效液相色谱图。图中保留时间为24.178min的色谱峰为染料木素。具体实施例方式将1.6mg大豆异黄酮(染料木苷含量为95.8% (w/w))和200 μ L 二甲基亚砜加入至Ij 1.5mL的微量离心管中，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苷元型大豆异黄酮的制备方法，其特征在于采用以下步骤：(1)将总糖苷含量在40％(w/w)以上的大豆异黄酮，加入到浓度为10?60％(v/v)的二甲基亚砜(含pH值为3?7的缓冲液)中，混匀，使底物的浓度为0.05?0.55％(w/v)；(2)将上述底物溶液在50?100℃预热3min?1hr；(3)加入酶活力为10?500U/mL反应液的依赖热丝菌Thermofilum?pendens?beta?葡萄糖苷酶，混匀；(4)继续在50?100℃保温10min?2hr，然后冷却至室温；(5)通过活化的碳十八柱或大孔吸附树脂柱，吸附异黄酮、再水洗除糖和盐、最后以70％(v/v)乙醇解析异黄酮。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，李晓磊，
申请(专利权)人：长春大学，李丹，李晓磊，
类型：发明
国别省市：