本发明专利技术提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括改造细菌使其乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，用改造的细菌发酵生产L-赖氨酸。另外，本发明专利技术还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于氨基酸发酵领域，具体而言，本专利技术涉及发酵生产L-赖氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。
技术介绍
通过产L-赖氨酸的细菌(如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌)发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在pnt、dap及ppc等基因上，未见为了 L-赖氨酸生产而关注乌头酸酶(如，乌头酸酶A)及其编码基因。乌头酸酶是三羧酸循环中的一个酶，该酶催化两步化学反应，分别为柠檬酸转化为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬酸。目前已知在埃希氏菌中，acnA基因(其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示)编码乌头酸酶A，但是可能是由于其代谢距离最终的L-赖氨酸产物太远，中间代谢分支太多且复杂，而在L-赖氨酸发酵中一直未引起人们的重视。本专利技术人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现acnA基因的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量；然而，现有技术要么通过增加拷贝和/或定点突变导入表达量和/或酶活性提高的有益的酶基因，要么通过敲除不利的基因以使之酶活性和/或表达量消失，但是与之不同的是，本专利技术人发现，acnA基因不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对acnA基因调控的方法，以此来提高L-赖氨酸的产量，而且该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产L-赖氨酸。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本专利技术还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括:(I)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，(2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。 在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本专利技术的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的PKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，改造成能够使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失的新的acnA基因。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。本专利技术人经过长期研究发现，使得acnA基因所编码的乌头酸酶A的表达量消失，或使得acnA基因所编码的乌头酸酶A的酶活性消失，都将造成细菌本身生长困难，甚至无法生长/繁殖。因此，本专利技术的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失，优选使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低20 % 95 %，更优选降低50 % 90 %，如降低65 %、70 %或80 %。相应地，本专利技术还提供了其他应用或方法。例如，在第二方面，本专利技术提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法,其包括:(I)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，(2)用步骤(I)改造而得到的细菌发酵产生L-赖氨酸。L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸。尽管低产L-赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产L-赖氨酸，但是通过本专利技术的方法，仍旧能提高L-赖氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-赖氨酸的细菌。通过本专利技术的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本专利技术的方法或应用中，除了改造细菌染色体上的野生型的acnA基因以外，可以不再进行其他改造。例如，尤其对于高产L-赖氨酸的细菌来说，仅仅改造细菌染色体上的野生型的acnA基因。又如，在第三方面，本专利技术提供了改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表 达量和/或酶活性降低但不消失。改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产L-赖氨酸中。在本文中，如无特别限定(如未以“改造获得”来限定)，术语“细菌”是未改造或改造前的细菌，其染色体的acnA基因座位上的基因是野生型的acnA基因。还如，在第四方面，本专利技术提供了改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的acnA基因而获得，而且使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。在本文中，细菌优选是埃希氏菌属细菌,更优选是大肠杆菌,如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在L-赖氨酸生产/发酵中关注过细菌的acnA基因，改造的染色体的基因大多集中于pnt、dap及ppc等基因位点上，因此现有技术中的细菌(尤其是埃希氏菌属细菌，如大肠杆菌)没有被报道不带有野生型的acnA基因。在本专利技术的具体实施方式中，无论高产还是低产L-赖氨酸的细菌，只要带有野生型的acnA基因，通过本专利技术的方法进行改造，就能使得L-赖氨酸的发酵量得到提高。更本质地，在第五方面，本专利技术提供了改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失。本专利技术第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生L-赖氨酸。因此，在第六方面，本专利技术提供了本专利技术第五方面的方法改造而获得的细菌。埃希氏菌属细菌(如，大肠杆菌)中绝大多数的野生型的acnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，而且本专利技术的具体实施方式也证实了在多种染色体上带有如SEQ IDNo:1所示的野生型的acnA基因的细菌上实施本专利技术的改造，都能提高L-赖氨酸的发酵量。所以优选在本文中，所述野生型的acnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。经过本专利技术人研究和证实，更优选地，在本文中，所述改造细菌染色体上的野生型的acnA基因是将所述细菌的野生型的acnA基因的起始密码子突变。例如，将野生型的acnA基因的起始密码子ATG突变，如将如SEQ ID No:1所示的野生型的acnA基因的起始密码子ATG突变为GTG。也经过本专利技术人研究和证实，更优选地，在本文中，所述改造细菌染色体上的野生型的acnA基因是将所述细菌的野生型的acnA基因缺失1-120个核苷酸，优选缺失1_90个核苷酸，最优选缺失90个核本文档来自技高网...
【技术保护点】
发酵生产L?赖氨酸的方法，其包括：(1)改造细菌染色体上的野生型的acnA基因，使改造获得的细菌的乌头酸酶A的表达量和/或酶活性降低但不消失；和，(2)用步骤(1)改造而得到的细菌发酵生产L?赖氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马吉银，温廷益，陈金龙，梁勇，刘树文，魏爱英，杨立鹏，孟刚，任瑞，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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