一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，先在金纳米颗粒上修饰检测抗体/检测抗原；再进行ELISA检测形成捕获抗体/捕获抗原‑待测抗原/待测抗体‑检测抗体/检测抗原‑金纳米颗粒复合物；然后进行银铂染，在金纳米颗粒表面包裹银壳层和铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，再利用其催化过氧化物酶底物得到有色产物，从而可以检测得到待测抗原/待测抗体的量。本发明专利技术采用先修饰后成酶的方法，具有简单、快捷的优点和很好的稳定性，能够有效避免非特异性吸附及修饰导致的纳米酶颗粒催化活性下降，为环境监测和疾病诊断提供新的平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析检测
，具体涉及一种基于纳米酶的ELISA检测方法，更具体地是涉及一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法。
技术介绍
过氧化物酶是一种在过氧化氢存在下，能够催化电子给体氧化的蛋白酶。目前，过氧化物酶已经被广泛的应用于化学传感、环境检测和疾病诊断，例如，辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体可用于ELISA检测。然而，蛋白酶具有易失活、不易保存和难制备等不足，极大的限制了过氧化物酶的应用范围。纳米酶是具有类似于蛋白酶催化能力的纳米材料，它们有合成简单、成本低廉和催化活性强的优点，能够很好的弥补蛋白酶的不足。在各种纳米酶中，铂纳米颗粒由于极强的过氧化物酶活性而被广泛的应用于环境监测与疾病诊断。然而铂纳米颗粒催化活性不稳定、容易发生团聚，并且会由于表面修饰抗体而使催化活性下降，限制了具有过氧化物酶活性的纳米酶在分析检测中的应用。因此，发展简单、快捷、稳定且能够避免由于修饰导致催化活性下降的方法，制备具有强过氧化物酶活性的纳米酶具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种基于纳米酶的ELISA检测方法，该种纳米酶通过银铂染的方法制备，具有过氧化物酶活性，本专利技术能够解决现有技术中纳米酶催化活性不稳定，容易由于修饰导致催化活性降低的问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，适用于双抗体夹心法或双抗原
夹心法，其中双抗体夹心法的检测步骤包括：a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；该检测抗体还可以为特异性结合蛋白、小分子蛋白或细胞抗体等；c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物；e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗原的量。双抗原夹心法的检测步骤包括：a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；d’)对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物；e’)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗体的量。一实施例中：所述步骤b)或b’)中，金纳米颗粒粒径为13～20nm。一实施例中：所述步骤d)或d’)中，Ag+溶液的终浓度为100～150μM。一实施例中：所述步骤d)或d’)中，对苯二酚的终浓度为0.2～1mM。一实施例中：所述步骤d)或d’)中，PtCl62-溶液的终浓度为0.4～0.6mM。一实施例中：所述步骤d)或d’)中，抗坏血酸的终浓度为10～20mM。一实施例中：所述步骤e)或e’)中，过氧化氢的浓度为1～5M。一实施例中：所述步骤e)或e’)中，所述过氧化物酶底物为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)；利用具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化TMB得到有色产物，在450nm检测有色产物的吸光度，以计算得到待测抗原或待测抗体的量。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种具有过氧化物酶活性的纳米酶制备方法，其特征在于：包括：1)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰蛋白质，得到修饰有蛋白质的金纳米颗粒；或直接选用粒径5～30nm的金纳米颗粒，不修饰蛋白质；其中，所述蛋白质可以为抗体或抗原，相应地制备得到的修饰后的金纳米颗粒可应用于
ELISA的双抗体夹心法或双抗原夹心法；当然，所述蛋白质也可以为其他种类；2)对步骤1)得到的修饰有蛋白的金纳米颗粒进行银铂染，或直接对不修饰蛋白质的金纳米颗粒进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到Au@AgPt颗粒，即为所述之具有过氧化物酶活性的纳米酶。其中，当所述蛋白质为抗体或抗原时，得到的纳米酶可以用于ELISA检测中，作用于过氧化物酶底物并用于检测。当所述蛋白质为其他种类时，可以相应地用于其他用途。若直接对未修饰蛋白质的金纳米颗粒进行银铂染，则得到的纳米酶也可以单纯地作为过氧化物酶使用。本专利技术还提供了根据上述制备方法所制备的具有过氧化物酶活性的纳米酶。本技术方案与
技术介绍
相比，它具有如下优点：首先，本专利技术利用金纳米颗粒表面与蛋白的强吸附作用，可以有效避免检测抗体或检测抗原修饰的金纳米颗粒发生非特异性吸附；其次，本专利技术先将检测抗体或检测抗原修饰在金纳米颗粒上，进行ELISA检测反应后，再利用银铂染形成具有强过氧化物酶活性的纳米颗粒，即先修饰再成酶，从而避免了传统先成酶再修饰技术中修饰过程导致的酶催化活性下降；然后，本专利技术制备的具有过氧化物酶活性的纳米酶具有催化活性强、稳定且重现性好的优点，其催化形成的有色产物能够进行可视化检测或通过酶标仪进行可视化检测，容易实现商品化。综上所述，与基于铂纳米颗粒的ELISA方法相比，本专利技术的方法简单、快捷、稳定性好，且能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，其特征在于：适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，包括：a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体‑待测抗原‑检测抗体‑金纳米颗粒复合物；d)对步骤c)得到的捕获抗体‑待测抗原‑检测抗体‑金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62‑溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62‑以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体‑待测抗原‑检测抗体‑Au@AgPt颗粒复合物；e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体‑待测抗原‑检测抗体‑Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗原的量；或，a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕获抗原‑待测抗体‑检测抗原‑金纳米颗粒复合物；d’)对步骤c’)得到的捕获抗原‑待测抗体‑检测抗原‑金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62‑溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62‑以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗原‑待测抗体‑检测抗原‑Au@AgPt颗粒复合物；e’)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d’)得到的捕获抗原‑待测抗体‑检测抗原‑Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗体的量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于具有过氧化物酶活性的纳米酶的ELISA检测方法，其特征在于：适用于双抗体夹心法或双抗原夹心法，包括：a)根据待测样品中待测抗原的种类选择相应的捕获抗体和检测抗体；b)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a)所述的检测抗体，得到修饰有检测抗体的金纳米颗粒；c)进行ELISA检测：包被捕获抗体→加入待测样品使待测抗原与捕获抗体结合→加入步骤b)得到的修饰有检测抗体的金纳米颗粒并使待测抗原与其中的检测抗体结合，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物；d)对步骤c)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表面再包裹铂壳层，得到具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒，形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物；e)在0.1～10M过氧化氢存在条件下，利用步骤d)得到的捕获抗体-待测抗原-检测抗体-Au@AgPt颗粒复合物中具有过氧化物酶活性的纳米酶Au@AgPt颗粒催化过氧化物酶底物得到产物，检测产物的量以得到待测抗原的量；或，a’)根据待测样品中待测抗体的种类选择相应的捕获抗原和检测抗原；b’)在粒径5～30nm的金纳米颗粒上修饰步骤a’)所述的检测抗原，得到修饰有检测抗原的金纳米颗粒；c’)进行ELISA检测：包被捕获抗原→加入待测样品使待测抗体与捕获抗原结合→加入步骤b’)得到的修饰有检测抗原的金纳米颗粒并使待测抗体与其中的检测抗原结合，形成捕
\t获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物；d’)对步骤c’)得到的捕获抗原-待测抗体-检测抗原-金纳米颗粒复合物进行银铂染：加入Ag+溶液和对苯二酚并使其终浓度分别为62.5～250μM和0.04～5mM，利用对苯二酚还原Ag+以在复合物中的金纳米颗粒表面包裹银壳层；洗涤；加入PtCl62-溶液和抗坏血酸并使其终浓度分别为0.25～1mM和2～50mM，利用抗坏血酸还原PtCl62-以在包裹了银壳层的金纳米颗粒表...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，刘芳，李久兴，何梦逸，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35