本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶诊断试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、胺类化合物、含氧酸、氨基酸脱氢酶、ＮＡＤＨ过氧化物酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单胺氧化酶诊断试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定单胺氧化酶活性浓度的方法，属于医学检验测定
技术介绍
现有技术中，测定单胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有：荧光法、免疫抑制法和化学分光光度法。荧光法是以β-苯乙胺作为底物来检测单胺氧化酶，其依据是：β-苯乙胺在10～100mg时反应速度最大，高于苄胺和5-羟色胺的反应速度。免疫学方法则利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，测定反应后形成的单胺氧化酶同工酶，目前应用较多的单克隆抗体有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。相对而言，化学分光光度法应有更为普遍。可以用单胺氧化酶催化胺类释放出的过氧化氢(H2O2)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定，也可以应用苄胺(Benzylamine)、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又称“3-对羟基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等作为反应底物来测定单胺氧化酶的活性。其中，应用苯甲胺类型底物测得的单胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物测得的活性约为3-对羟基苯乙胺作底物的30％。目前，单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚作为底物。苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，这在生化仪上测定较困难；对苯甲胺-β-偶氮萘酚方法则需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定单胺氧化酶活性浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的单胺氧化酶诊断试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行单胺氧化酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术单胺氧化酶活性浓度测定方法如下：胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+过氧化氢氨+含氧酸+还原型辅酶氨基酸脱氢酶氨基酸+水+辅酶过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+2水-->这种方法应用单胺氧化酶(Monoamine Oxidase；EC 1.4.3.4；EC 1.4.3.6)酶(偶)联氨基酸脱氢酶(amino-acid dehydrogenase；EC 1.4.1.5；EC 1.4.99.1)、NADH过氧化物酶(NADH peroxidase；EC 1.11.1.1；EC 1.11.1.2)酶促反应连续监测法。单胺氧化酶酶解胺类化合物反应产生氨及过氧化氢，再分别通过(偶)联合氨基酸脱氢酶、NADH过氧化物酶的作用，最终二次将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算单胺氧化酶的活性浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术单胺氧化酶诊断/测定试剂较为理想：缓冲液 100mmol/L稳定剂 500mmol/L还原型辅酶 0.25mmol/L氨基酸脱氢酶 10000U/LNADH过氧化物酶10000U/L胺类化合物 12mmol/L含氧酸 15mmol/L本专利技术测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述“胺类化合物”优选以下物质之一：苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。本专利技术的单胺氧化酶诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸脱氢酶、NADH过氧化物酶、胺类化合物、含氧酸。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、含氧酸。试剂2缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、NADH过氧化物酶。还原型辅酶、氨基酸脱氢酶、NADH过氧化物酶、胺类化合物、含氧酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、胺类化合物、含氧酸。试剂2缓冲液、稳定剂、NADH过氧化物酶。试剂3缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶。-->还原型辅酶、氨基酸脱氢酶、NADH过氧化物酶、胺类化合物、含氧酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定单胺氧化酶活性浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。具体实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的单胺氧化酶诊断/测定试剂为单试剂，包括：三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500mmol/L还原型辅酶 0.25mmol/L氨基酸脱氢酶 10000U/LNADH过氧化物酶 10000U/L苄胺 12mmol/L含氧酸 15mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测单胺氧化酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值-4180。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出单胺氧化酶的活性浓度大小。实施例二本实施例的单胺氧化酶诊断/测定试剂为双试剂，包括：试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50mmol/L还原型辅酶 0.25mmol/L苄胺 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法如下： 胺类化合物＋水＋氧单胺氧化酶相应醛类产物＋氨＋过氧化氢 氨＋含氧酸＋还原型辅酶氨基酸脱氢酶氨基酸＋水＋辅酶 过氧化氢＋还原型辅酶ＮＡＤＨ过氧化物酶辅酶＋２水 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小结果。
【技术特征摘要】
1.一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的单胺氧化酶活性浓度测定方法，其方法如下：胺类化合物+水+氧单胺氧化酶相应醛类产物+氨+过氧化氢氨+含氧酸+还原型辅酶氨基酸脱氢酶氨基酸+水+辅酶过氧化氢+还原型辅酶NADH过氧化物酶辅酶+2水将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出单胺氧化酶的活性浓度大小结果。2.一种单胺氧化酶诊断试剂(盒)，主要成分包括：缓冲液 20——500mmol/L稳定剂 1——4000mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L氨基酸脱氢酶 1000——80000U/LNADH过氧化物酶 1000——80000U/L胺类化合物 1——50mmol/L含氧酸 1——50mmol/L本发明测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述“胺类化合物”优选以下物质之一：苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可...
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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