内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒技术

本发明专利技术提供一种方法，通过使待测样品、含有与内毒素结合而活化的Ｃ因子的试剂、在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物中游离出发光底物，使发光酶作用于游离的发光底物并测定发光量，根据所得的测定值定量样品中的内毒素浓度，由此，无需使用专用的测定装置，即可简便且快速地测定用现有内毒素测定方法无法检测的水平的内毒素。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及样品中所含的内毒素的浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。具体而 言，涉及利用生物发光反应的内毒素浓度测定方法及浓度测定用试剂盒。
技术介绍
“内毒素(endotoxin) ”是革兰氏阴性细菌外膜的构成成分之一，其活性主体为脂 多糖(LPS，lipopolysaccharide)。生物体内的内毒素在革兰氏阴性细菌的表层作为外膜 的一部分而存在。另外，通常在革兰氏阴性细菌死亡后，以游离内毒素的形式游离存在于血 流中。内毒素在血液中存在一定量以上时，由于该内毒素的刺激，单核细胞或粒细胞等 产生过量的炎症性细胞因子。结果引起称为内毒素血症的发热、败血症、败血症性休克或多 器官衰竭等症状。因此，注射用医药品等中的内毒素的检测极为重要，日本、美国和欧洲的 药典中都收录了内毒素试验方法。另外，在临床诊断上，认为准确测定血液中的内毒素，对 于早期诊断和治疗效果的判定是极为重要的。作为现有的内毒素测定方法，已知有将待测样品直接注射到兔体内，根据其体 温升高测定内毒素量的热原(pyrogen)试验，以及利用鲎的血细胞提取液(amebocyte lysate)因内毒素而凝胶化的现象的鲎试剂试验。其中，直接向兔体内注射的方法，在成本 方面、获得结果所需的时间及灵敏性方面存在问题，因此，目前主要采用鲎试剂试验作为内 毒素的测定方法。图1表示由内毒素引起的鲎血细胞提取液的凝胶化反应的过程。在鲎血细胞提取 液中存在与内毒素发生特异性反应的C因子途径。“C因子途径”由以下级联反应构成。首 先，内毒素与C因子(Factor C)牢固结合而使C因子活化。接着，由内毒素的结合而活化 的C因子(活化型C因子)使B因子(Factor B)活化。然后，活化的B因子(活化型B因 子)进一步使凝固酶原(proclotting enzyme)活化而生成凝固酶(clotting enzyme)。该 凝固酶使作为其底物的凝固蛋白原(coagulogen)部分水解。结果，从凝固蛋白原中游离出 C肽(p印tide C)，生成凝固蛋白(coagulin)。由于该凝固蛋白的凝固作用而产生凝胶化 (参考非专利文献1)。利用鲎试剂试验的内毒素测定方法，应用了上述的鲎血细胞提取液因内毒素而凝 胶化的过程。鲎试剂试验根据判定方法或测定方法的不同，已知有凝胶化翻转法(凝胶化 法)、合成发色底物法(比色法)以及比浊时间分析法(比浊法)等方法(参考非专利文献 2)。“凝胶化翻转法”是将待检测样品与鲎血细胞提取液在试管内混合，在一定条件下 (例如37°C下30 60分钟)使其反应后，在将该试管翻转或倾斜时，通过样品是维持液态 还是固化来进行判断的方法。前者的情况下为内毒素阴性，后者的情况下为阳性。该方法虽 然无需特别的装置，操作也较容易，但是测定结果容易因原料和制造批次的不同而改变，而 且由于由人进行判断因而与光学方法相比存在欠客观的问题，因此通常只用于粗略测定。4“合成发色底物法”是使用合成发色肽底物作为凝固酶的底物，根据吸光度对游离 出的发色基团量进行比色定量，由此计算内毒素量的方法。合成发色肽底物是模仿天然底 物凝固蛋白原中的凝固酶水解位点的氨基酸序列的合成底物。使对硝基苯胺(PNA)等发色 基团结合在凝固酶的切割位点上，该发色基团通过酶切游离出来而发色。当发色基团为对 硝基苯胺时，随时间推移测定对硝基苯胺的最大吸收波长405nm的吸光度。另外，当发色基 团为对硝基苯胺的重氮化偶联物时，随时间推移测定545nm的吸光度。然后，对所得的随时 间推移的透光量的变化进行分析，从而测定内毒素浓度。该合成发色底物法虽然也存在试 剂价格较高、操作繁杂等问题，但定量性、灵敏性及客观性优良。“比浊时间分析法”是监测凝胶化导致的浊度增加作为透光量的变化，以反应液的 透光量比减少到一定阈值(通常为90%左右)所需的时间作为凝胶化时间，使用根据凝胶 化时间与内毒素浓度的关系而制作的标准曲线来计算内毒素值的方法。该方法的定量性和 客观性非常优良，但是测定需要专用装置。此外，有利用重组C因子和荧光底物、能以高灵敏度测定内毒素的试剂盒(商品 名PyroGene-rFc，Lonza ffalkersville, Inc.制造，第一化学药品株式会社销售)市售。非专利文献 1 :T. Miyata, M. Hiranaga et al. , Amino Acid Sequenceof the Coagulogen from Limulus polyphemus Hemocytes, The Journal ofBiological Chemistry,259，8924-8933(1984)非专利文献2 第15版修订日本药典，4. 01内毒素试验法，P70-73
技术实现思路
如上所述，合成发色底物法或比浊时间分析法等鲎试剂试验是定量性、客观性优 良的内毒素测定方法。然而，即使采用这些方法，在测定内毒素时仍被指出各种问题。例如 其结果与临床症状未必对应等问题。具体而言，可以列举以下情况即使采用的是鲎试剂试 验得到阴性结果的输液或透析液，但却经常出现发热等认为由内毒素引起的病例；或者虽 然临床上诊断为由于血液中革兰氏阴性细菌感染而发生的重症革兰氏阴性细菌感染症，但 是通过鲎试剂试验测定的血中内毒素浓度水平并不显示阳性。其原因认为是在目前的情况 下鲎试剂试验灵敏度尚存在问题。因此，开发灵敏度更高的内毒素测定方法成为当务之急。并且，期待开发无需使用 专用的测定装置、能够简单地实施的方法。本专利技术是鉴于上述问题而做出的，其目的在于提供无需使用专用的测定装置，即 可简便且快速地测定用现有内毒素测定方法无法检测的水平的内毒素的方法。本专利技术人为解决上述问题进行了潜心研究，结果发现，通过在现有鲎试剂试验中 应用生物发光反应，能够简便、快速且高灵敏度地测定样品中的内毒素，从而完成了本发 明。即，本专利技术的内毒素浓度测定方法，是测定样品中所含的内毒素的浓度的方法，其 特征在于，包括发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及 在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从合成发光底物中游离出发光底物；发 光量测量步骤，使发光酶作用于通过发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量; 和浓度定量步骤，根据通过发光量测量步骤得到的测定值定量样品中的内毒素浓度。合成发光底物优选具有通过C因子活化而生成的活化型C因子、活化型B因子及 凝固酶中的任何一种的作用，使发光底物与肽之间的键被切断的结构。另外，发光底物优选 为氨基荧光素，发光酶优选为荧光素酶。荧光素酶优选来自于选自由北美萤(Photinus pyralis))、源氏萤(Luciola cruciata)、平家萤(Luciola lateralis))、小真菌虫内(Arachnocampaluminosa)、姬萤 (Hotaria parvula)、窗萤(Pyrocoelia)、北方锯角萤(Lucidinabiplagiata)、发光口口头虫 (Pyrearinus termitilluminan)禾口铁路螺虫(Phrixothrix hirtus)组成的组中的甲虫。 另外，荧光素酶优选为变异型荧光素酶，该变异型荧光素酶改变了野生型荧光素酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内毒素浓度测定方法，用于测定样品中所含的内毒素的浓度，其特征在于，包括；发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的Ｃ因子的试剂及在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从该合成发光底物中游离出所述发光底物；发光量测量步骤，使发光酶作用于通过所述发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量；和浓度定量步骤，根据通过所述发光量测量步骤得到的测定值定量所述样品中的内毒素浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-11-12 2007-293491一种内毒素浓度测定方法，用于测定样品中所含的内毒素的浓度，其特征在于，包括；发光底物游离步骤，使样品、含有与内毒素结合而活化的C因子的试剂及在肽上结合发光底物而形成的合成发光底物反应，从该合成发光底物中游离出所述发光底物；发光量测量步骤，使发光酶作用于通过所述发光底物游离步骤游离出的发光底物，并测定发光量；和浓度定量步骤，根据通过所述发光量测量步骤得到的测定值定量所述样品中的内毒素浓度。2.如权利要求1所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述合成发光底物具有通 过所述C因子活化而生成的活化型C因子、活化型B因子及凝固酶中的任何一种的作用使 所述发光底物与所述肽之间的键被切断的结构。3.如权利要求2所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述发光底物是氨基荧光 素，所述发光酶是荧光素酶。4.如权利要求3所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶来自于选自 由北美萤、源氏萤、平家萤、小真菌蚋、姬萤、窗萤、北方锯角萤、发光叩头虫和铁路蠕虫组成 的组中的甲虫。5.如权利要求3或4所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述荧光素酶是变异型 荧光素酶，该变异型荧光素酶改变了野生型荧光素酶的氨基酸序列，使发光强度比野生型 荧光素酶增强。6.如权利要求5所述的内毒素浓度测定方法，其特征在于，所述变异型荧光素酶为选 自由以下(i) (ν)组成的组中的一种(i)包含将序列编号13所示的野生型北美萤荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：黑田章夫，野田健一，
申请(专利权)人：国立大学法人广岛大学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]