System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 使用铂TALEN的T细胞受体的完全取代技术制造技术_技高网

使用铂TALEN的T细胞受体的完全取代技术制造技术

技术编号:40954195 阅读:9 留言:0更新日期:2024-04-18 20:30
本发明专利技术提供一种排除在导入TCR基因时因内源性TCR导致的影响的技术。本发明专利技术使用基因组编辑酶来编辑TCR基因,作为基因组编辑酶的特征之一在于,其DNA结合结构域所包含的DNA结合模块中的两个特定的位置的氨基酸呈现出按4个DNA结合模块各不相同的重复模式。避免因与内源性TCR的错配导致的导入TCR表达效率的降低和/或自身反应性TCR的出现。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及t细胞的生物工程学操作。


技术介绍

1、抗原特异性t细胞受体(tcr)基因导入技术,作为针对恶性肿瘤或病毒感染的效应t细胞(teff)的过继转移免疫疗法的手段,近年来需求不断提高。然而,迄今为止开发的方法无法完全避免驻留在t细胞中的tcr和已导入的新tcr共表达的影响。

2、并且,调节性t细胞(treg)为在体内的免疫应答调节中起到主要作用的细胞群,其调节作用被认为是抗原非特异性,近年来,已经明确存在有与特定的自身抗原、同种抗原反应来发挥免疫调节作用的抗原特异性treg。据报道,抗原特异性treg在自身免疫疾病的模型中发挥出高于以往treg的有效性。然而,迄今为止还未开发出对于任意所期望的抗原、在制备对该抗原特异性的treg时在防止与内源性tcr共表达的影响的同时、将外源性tcr导入treg中的技术。


技术实现思路

1、用于解决课题的方法

2、在本专利技术一个方面,提供用于编辑内源性tcr基因的、基因组编辑酶修饰talen或包含其的组合物。可通过用修饰talen编辑并切断内源性tcr基因来制备出不表达内源性tcr的t细胞。在一个实施方式中,将被称为铂talen(platinum talen)的talen用作修饰talen。铂talen的特征之一为:其dna结合结构域所包含的dna结合模块中的两个特定位置的氨基酸呈现出按4个dna结合模块各不相同的重复模式。铂talen具有如下特征:同时实现因功能结构域带来的高功能性和针对dna序列的高识别特异性

3、在本专利技术一个方面,提供一种方法,包括使用本专利技术的修饰talen来去除调节性t细胞中的内源性tcr基因的步骤。例如,使用修饰talen切断从外周血分离的treg的tcr基因,可以抑制内源性tcr的表达。本专利技术的修饰talen由于高的切断效率而可进一步完全抑制内源性tcr的表达,此外,由于序列识别特异性高,所以可以将因t细胞中的脱靶基因修饰带来的危险性抑制得较低。

4、在本专利技术一个方面,可提供一种方法,包括将tcr基因导入通过本专利技术的修饰talen去除了内源性tcr基因的treg中的步骤。根据以上特性,认为在与tcr的编辑一同导入新的tcr时本专利技术的修饰talen是有用的。由此,可制备出表达tcr(所期望抗原特异性地显示高结合能力)的treg。

5、在一个方面,本专利技术提供用于编辑tcr基因的组合物或试剂盒。在又一个方面,提供用于制备tcr修饰t细胞的组合物或试剂盒。

6、在本专利技术中,还提供利用本专利技术的方法制备的t细胞(例如,调节性t细胞)。此类调节性t细胞在所期望的免疫抑制的各种情况下是有用的。例如,本专利技术的调节性t细胞可用于自身免疫疾病、过敏性疾病或移植时的移植物抗宿主病(gvhd)、排斥反应或移植失败的治疗或预防。在本专利技术中还提供用于在本专利技术的方法中使用的物质。

7、另外,根据上述特性,本专利技术的修饰talen在具有如下特征的方法中的使用方面是有用的。在以t细胞(例如,调节性t细胞)中使效应t细胞的t细胞受体(tcr)表达作为特征的方法中的使用方面,本专利技术的修饰talen是有用的。在一个实施方式中,本专利技术的方法包括将全部或部分tcr基因导入调节性t细胞中的步骤,该步骤中以tcrα及tcrβ成对表达的方式导入。在与所期望的抗原反应的效应t细胞中,鉴定和/或分离具有高抗原结合能力的tcr,并可用于向t细胞的导入。本专利技术的一个实施方式的特征之一在于,在通过本专利技术的修饰talen使内源性tcr缺损的调节性t细胞(treg)中,仅表达从与所期望的抗原反应的效应t细胞(teff)获得的高抗原结合能力的tcr。可基于对抗原具有特异性的效应t细胞群中存在的t细胞受体(tcr)克隆的频率,鉴定高抗原结合能力的tcr。tcr的鉴定可使用测定tcr库的方法,所述方法包括无偏差地(no-bias)扩增tcr的核酸序列的步骤。在本专利技术中,可使用鉴定和/或分离抗原结合能力高的tcrα和tcrβ对的方法。例如,可使用hla四聚体等分离与所期望的抗原特异性反应的效应t细胞(teff)群,并获得包含它们表达的tcrα链·tcrβ链的抗原识别区域的基因序列。进而,针对每个所得tcr克隆型对所期望抗原的结合能力,进行评估。

8、例如,本专利技术提供以下专利技术。

9、(项目1)一种用于编辑tcr基因的组合物,含有包含dna结合结构域及功能结构域的多肽或编码所述多肽的核酸,

10、其中,所述dna结合结构域和所述功能结构域通过由35~55个氨基酸组成的多肽连接,

11、dna结合结构域从n末端侧起连续地包含多个dna结合模块,

12、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

13、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

14、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

15、从n末端起第4n个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

16、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合及从n末端起第4n个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合互不相同,

17、在此,n为1~10的自然数,x为1~40的自然数,y为1~40的自然数,x和y为不同的自然数。

18、(项目2)如上述项目所述的组合物,其中,

19、所述dna结合结构域和所述功能结构域通过由40~50个氨基酸组成的多肽相连接,

20、所述dna结合结构域从n末端侧起连续地包含16~20个由34个氨基酸组成的dna结合模块,

21、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

22、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

23、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

24、从n末端起第4n个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合,对于任意的n相同,

25、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合以及从n末端起第4n个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合互不相同,

26、在此,n为1~5的自然数,所述dna结合本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于编辑TCR基因的组合物,其特征在于,

2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,

3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述功能结构域为DNA切断结构域。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其特征在于,所述DNA结合结构域与TCRα基因或TCRβ基因特异性结合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其特征在于,所述DNA结合结构域与TRAC外显子1、TRBC1外显子1或TRBC2外显子1特异性结合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物,其特征在于,所述DNA结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其特征在于,包含表达载体,所述表达载体含有编码所述多肽的所述核酸。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其特征在于,以mRNA的形式包含编码所述多肽的所述核酸。

9.一种编辑TCR基因的方法,其特征在于,包括将权利要求1~8中任一项所述的组合物导入细胞的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,包括:

11.根据权利要求9或10所述的方法,其特征在于,所述TCR基因的编辑为内源性TCR基因的去除。

12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,还包括将外源性TCR基因导入所述细胞的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。

14.一种TCR修饰T细胞,其特征在于,通过权利要求13所述的方法制备。

15.一种包含权利要求14所述的TCR修饰T细胞的组合物,其特征在于,用于针对对象的癌症进行治疗。

16.根据权利要求15所述的组合物,其特征在于,所述癌症为NY-ESO-1阳性的癌症。

17.一种用于编辑TCR基因的组合物,其特征在于,

18.一种用于编辑TCR基因的组合物,其特征在于,

19.一种用于编辑TCR基因的配合物,其特征在于,

20.一种多肽,其特征在于,

21.根据权利要求20所述的多肽,其特征在于,

22.根据权利要求20或21所述的多肽,其特征在于,所述功能结构域为DNA切断结构域。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的多肽,其特征在于,所述DNA结合结构域与TRAC外显子1、TRBC1外显子1或TRBC2外显子1特异性结合。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的多肽,其特征在于,所述DNA结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的多肽,其特征在于,所述DNA结合结构域包含序列号86的氨基酸序列、序列号87的氨基酸序列、序列号88的氨基酸序列、序列号89的氨基酸序列、序列号90的氨基酸序列或序列号91的氨基酸序列。

26.一种核酸,其特征在于,所述核酸编码权利要求20~25中任一项所述的多肽的全部或一部分。

27.一种用于编辑TCR基因的试剂盒,其特征在于,包含:

28.一种用于编辑TCR基因的试剂盒,其特征在于,包含:

29.根据权利要求27或28所述的试剂盒,其特征在于,用于用外源性TCR基因取代内源性TCR基因。

30.根据权利要求27至29中任一项所述的试剂盒,其特征在于,用于制备TCR修饰调节性T细胞。

31.根据权利要求27至29中任一项所述的试剂盒,其特征在于,用于制备TCR修饰T细胞,所述TCR修饰T细胞表达具有对NY-ESO-1特异性的外源性TCR。

32.一种包含目标外源性TCR的细胞的细胞群,其特征在于,包含除所述目标外源性TCR以外的外源性TCR的细胞在所述细胞群中的比率为小于10%。

33.根据权利要求32所述的细胞群,其特征在于,所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。

34.一种制备权利要求32所述的细胞群的方法,其特征在于,包括:

35.根据权利要求34所述的方法,其特征在于,所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。

...

【技术特征摘要】

1.一种用于编辑tcr基因的组合物,其特征在于,

2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,

3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述功能结构域为dna切断结构域。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其特征在于,所述dna结合结构域与tcrα基因或tcrβ基因特异性结合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其特征在于,所述dna结合结构域与trac外显子1、trbc1外显子1或trbc2外显子1特异性结合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物,其特征在于,所述dna结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其特征在于,包含表达载体,所述表达载体含有编码所述多肽的所述核酸。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其特征在于,以mrna的形式包含编码所述多肽的所述核酸。

9.一种编辑tcr基因的方法,其特征在于,包括将权利要求1~8中任一项所述的组合物导入细胞的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,包括:

11.根据权利要求9或10所述的方法,其特征在于,所述tcr基因的编辑为内源性tcr基因的去除。

12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,还包括将外源性tcr基因导入所述细胞的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述外源性tcr具有对ny-eso-1的特异性。

14.一种tcr修饰t细胞,其特征在于,通过权利要求13所述的方法制备。

15.一种包含权利要求14所述的tcr修饰t细胞的组合物,其特征在于,用于针对对象的癌症进行治疗。

16.根据权利要求15所述的组合物,其特征在于,所述癌症为ny-eso-1阳性的癌症。

17.一种用于编辑tcr基因的组合物,其特征在于,

18.一种用于编辑tcr基因的组合物,其特征在于,

19.一种用于编辑tcr基因的配合物,其特...

【专利技术属性】
技术研发人员:一户辰夫山本卓佐久间哲史本庶仁子川濑孝和美山贵彦铃木隆二
申请(专利权)人:国立大学法人广岛大学
类型:发明
国别省市:

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