【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及t细胞的生物工程学操作。
技术介绍
1、抗原特异性t细胞受体(tcr)基因导入技术，作为针对恶性肿瘤或病毒感染的效应t细胞(teff)的过继转移免疫疗法的手段，近年来需求不断提高。然而，迄今为止开发的方法无法完全避免驻留在t细胞中的tcr和已导入的新tcr共表达的影响。
2、并且，调节性t细胞(treg)为在体内的免疫应答调节中起到主要作用的细胞群，其调节作用被认为是抗原非特异性，近年来，已经明确存在有与特定的自身抗原、同种抗原反应来发挥免疫调节作用的抗原特异性treg。据报道，抗原特异性treg在自身免疫疾病的模型中发挥出高于以往treg的有效性。然而，迄今为止还未开发出对于任意所期望的抗原、在制备对该抗原特异性的treg时在防止与内源性tcr共表达的影响的同时、将外源性tcr导入treg中的技术。
技术实现思路
1、用于解决课题的方法
2、在本专利技术一个方面，提供用于编辑内源性tcr基因的、基因组编辑酶修饰talen或包含其的组合物。可通过用修饰talen编辑并切断内源性tcr基因来制备出不表达内源性tcr的t细胞。在一个实施方式中，将被称为铂talen(platinum talen)的talen用作修饰talen。铂talen的特征之一为：其dna结合结构域所包含的dna结合模块中的两个特定位置的氨基酸呈现出按4个dna结合模块各不相同的重复模式。铂talen具有如下特征：同时实现因功能结构域带来的高功能性和针对dna序列的高识别特异性
3、在本专利技术一个方面，提供一种方法，包括使用本专利技术的修饰talen来去除调节性t细胞中的内源性tcr基因的步骤。例如，使用修饰talen切断从外周血分离的treg的tcr基因，可以抑制内源性tcr的表达。本专利技术的修饰talen由于高的切断效率而可进一步完全抑制内源性tcr的表达，此外，由于序列识别特异性高，所以可以将因t细胞中的脱靶基因修饰带来的危险性抑制得较低。
4、在本专利技术一个方面，可提供一种方法，包括将tcr基因导入通过本专利技术的修饰talen去除了内源性tcr基因的treg中的步骤。根据以上特性，认为在与tcr的编辑一同导入新的tcr时本专利技术的修饰talen是有用的。由此，可制备出表达tcr(所期望抗原特异性地显示高结合能力)的treg。
5、在一个方面，本专利技术提供用于编辑tcr基因的组合物或试剂盒。在又一个方面，提供用于制备tcr修饰t细胞的组合物或试剂盒。
6、在本专利技术中，还提供利用本专利技术的方法制备的t细胞(例如，调节性t细胞)。此类调节性t细胞在所期望的免疫抑制的各种情况下是有用的。例如，本专利技术的调节性t细胞可用于自身免疫疾病、过敏性疾病或移植时的移植物抗宿主病(gvhd)、排斥反应或移植失败的治疗或预防。在本专利技术中还提供用于在本专利技术的方法中使用的物质。
7、另外，根据上述特性，本专利技术的修饰talen在具有如下特征的方法中的使用方面是有用的。在以t细胞(例如，调节性t细胞)中使效应t细胞的t细胞受体(tcr)表达作为特征的方法中的使用方面，本专利技术的修饰talen是有用的。在一个实施方式中，本专利技术的方法包括将全部或部分tcr基因导入调节性t细胞中的步骤，该步骤中以tcrα及tcrβ成对表达的方式导入。在与所期望的抗原反应的效应t细胞中，鉴定和/或分离具有高抗原结合能力的tcr，并可用于向t细胞的导入。本专利技术的一个实施方式的特征之一在于，在通过本专利技术的修饰talen使内源性tcr缺损的调节性t细胞(treg)中，仅表达从与所期望的抗原反应的效应t细胞(teff)获得的高抗原结合能力的tcr。可基于对抗原具有特异性的效应t细胞群中存在的t细胞受体(tcr)克隆的频率，鉴定高抗原结合能力的tcr。tcr的鉴定可使用测定tcr库的方法，所述方法包括无偏差地(no-bias)扩增tcr的核酸序列的步骤。在本专利技术中，可使用鉴定和/或分离抗原结合能力高的tcrα和tcrβ对的方法。例如，可使用hla四聚体等分离与所期望的抗原特异性反应的效应t细胞(teff)群，并获得包含它们表达的tcrα链·tcrβ链的抗原识别区域的基因序列。进而，针对每个所得tcr克隆型对所期望抗原的结合能力，进行评估。
8、例如，本专利技术提供以下专利技术。
9、(项目1)一种用于编辑tcr基因的组合物，含有包含dna结合结构域及功能结构域的多肽或编码所述多肽的核酸，
10、其中，所述dna结合结构域和所述功能结构域通过由35～55个氨基酸组成的多肽连接，
11、dna结合结构域从n末端侧起连续地包含多个dna结合模块，
12、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
13、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
14、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
15、从n末端起第4n个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
16、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合及从n末端起第4n个dna结合模块中的第x个氨基酸和第y个氨基酸的组合互不相同，
17、在此，n为1～10的自然数，x为1～40的自然数，y为1～40的自然数，x和y为不同的自然数。
18、(项目2)如上述项目所述的组合物，其中，
19、所述dna结合结构域和所述功能结构域通过由40～50个氨基酸组成的多肽相连接，
20、所述dna结合结构域从n末端侧起连续地包含16～20个由34个氨基酸组成的dna结合模块，
21、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
22、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
23、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
24、从n末端起第4n个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合，对于任意的n相同，
25、从n末端起第4n-3个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合、从n末端起第4n-2个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合、从n末端起第4n-1个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合以及从n末端起第4n个dna结合模块中的第4个氨基酸和第32个氨基酸的组合互不相同，
26、在此，n为1～5的自然数，所述dna结合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于编辑TCR基因的组合物，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述功能结构域为DNA切断结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述DNA结合结构域与TCRα基因或TCRβ基因特异性结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述DNA结合结构域与TRAC外显子1、TRBC1外显子1或TRBC2外显子1特异性结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述DNA结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，包含表达载体，所述表达载体含有编码所述多肽的所述核酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，以mRNA的形式包含编码所述多肽的所述核酸。
9.一种编辑TC
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述TCR基因的编辑为内源性TCR基因的去除。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括将外源性TCR基因导入所述细胞的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。
14.一种TCR修饰T细胞，其特征在于，通过权利要求13所述的方法制备。
15.一种包含权利要求14所述的TCR修饰T细胞的组合物，其特征在于，用于针对对象的癌症进行治疗。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述癌症为NY-ESO-1阳性的癌症。
17.一种用于编辑TCR基因的组合物，其特征在于，
18.一种用于编辑TCR基因的组合物，其特征在于，
19.一种用于编辑TCR基因的配合物，其特征在于，
20.一种多肽，其特征在于，
21.根据权利要求20所述的多肽，其特征在于，
22.根据权利要求20或21所述的多肽，其特征在于，所述功能结构域为DNA切断结构域。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的多肽，其特征在于，所述DNA结合结构域与TRAC外显子1、TRBC1外显子1或TRBC2外显子1特异性结合。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的多肽，其特征在于，所述DNA结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的多肽，其特征在于，所述DNA结合结构域包含序列号86的氨基酸序列、序列号87的氨基酸序列、序列号88的氨基酸序列、序列号89的氨基酸序列、序列号90的氨基酸序列或序列号91的氨基酸序列。
26.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求20～25中任一项所述的多肽的全部或一部分。
27.一种用于编辑TCR基因的试剂盒，其特征在于，包含：
28.一种用于编辑TCR基因的试剂盒，其特征在于，包含：
29.根据权利要求27或28所述的试剂盒，其特征在于，用于用外源性TCR基因取代内源性TCR基因。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于制备TCR修饰调节性T细胞。
31.根据权利要求27至29中任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于制备TCR修饰T细胞，所述TCR修饰T细胞表达具有对NY-ESO-1特异性的外源性TCR。
32.一种包含目标外源性TCR的细胞的细胞群，其特征在于，包含除所述目标外源性TCR以外的外源性TCR的细胞在所述细胞群中的比率为小于10％。
33.根据权利要求32所述的细胞群，其特征在于，所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。
34.一种制备权利要求32所述的细胞群的方法，其特征在于，包括：
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述外源性TCR具有对NY-ESO-1的特异性。
...【技术特征摘要】
1.一种用于编辑tcr基因的组合物，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述功能结构域为dna切断结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述dna结合结构域与tcrα基因或tcrβ基因特异性结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述dna结合结构域与trac外显子1、trbc1外显子1或trbc2外显子1特异性结合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述dna结合结构域与序列号80的核酸序列、序列号81的核酸序列、序列号82的核酸序列、序列号83的核酸序列、序列号84的核酸序列或序列号85的核酸序列特异性结合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，包含表达载体，所述表达载体含有编码所述多肽的所述核酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，以mrna的形式包含编码所述多肽的所述核酸。
9.一种编辑tcr基因的方法，其特征在于，包括将权利要求1～8中任一项所述的组合物导入细胞的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述tcr基因的编辑为内源性tcr基因的去除。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括将外源性tcr基因导入所述细胞的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述外源性tcr具有对ny-eso-1的特异性。
14.一种tcr修饰t细胞，其特征在于，通过权利要求13所述的方法制备。
15.一种包含权利要求14所述的tcr修饰t细胞的组合物，其特征在于，用于针对对象的癌症进行治疗。
16.根据权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述癌症为ny-eso-1阳性的癌症。
17.一种用于编辑tcr基因的组合物，其特征在于，
18.一种用于编辑tcr基因的组合物，其特征在于，
19.一种用于编辑tcr基因的配合物，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：一户辰夫，山本卓，佐久间哲史，本庶仁子，川濑孝和，美山贵彦，铃木隆二，
申请(专利权)人：国立大学法人广岛大学，
类型：发明
国别省市：
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