【技术实现步骤摘要】
一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法
本专利技术涉及生物
,特别是涉及一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法。
技术介绍
随着生命科学的发展和生物技术的进步,蛋白质检测已经在临床检验、食品安全、生物医药等领域得到了广泛的应用。例如,肿瘤标志物、心脑血管疾病标志物、内分泌疾病标志物等,80%以上都是蛋白质;食品过敏原的检测和标识、重组蛋白药物的质量评价,同样离不开蛋白质的准确定量。为了保证各领域蛋白质检测结果的准确可比,需要研制相应的蛋白质标准物质作为分析定量时的标准,蛋白质标准物质通常采用比常规分析更为准确的技术手段作为定值方法,如同位素稀释质谱法等。对于血清、食品等复杂基质中蛋白质的同位素稀释质谱定量过程一般如下:首先对目标蛋白质进行生物信息学分析,筛选出对应于目标蛋白的特异性肽段。接着通过化学法合成同位素标记及非标记的特异性肽段,并采用基于氨基酸分析的方法对非标记肽段进行准确定量,然后将同位素标记肽段添加到待测样品中,混匀后进行酶切。酶切结束后以非标记肽段为标准,以合成的同位素标记肽段为内标,对酶解液中的特异性肽段浓度进行同位素稀释质谱分析,根据酶解液 ...
【技术保护点】
一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:包括如下步骤:(1)对目标蛋白进行特异性肽段筛选,采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切,得到各条理论酶切肽段;将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索,确定出目标蛋白的特异性酶切肽段;(2)通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段;采用同位素标记的氨基酸合成出同位素标记的特异性肽段,通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯品,采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数Ppeptide;(3)获得待测目标蛋白的纯品,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出蛋白质纯品中蛋白质的 ...
【技术特征摘要】
1.一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:包括如下步骤:(1)对目标蛋白进行特异性肽段筛选,采用蛋白酶对目标蛋白进行理论酶切,得到各条理论酶切肽段;将得到的理论酶切肽段逐条利用Blast工具检索,确定出目标蛋白的特异性酶切肽段;(2)通过化学合成的方法采用氨基酸合成出特异性肽段;采用同位素标记的氨基酸合成出同位素标记的特异性肽段,通过反相高效液相色谱法对合成的肽段进行纯化得到纯品,采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出合成肽段中目标肽段的质量分数Ppeptide;(3)获得待测目标蛋白的纯品,并采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱方法测定出蛋白质纯品中蛋白质的质量分数Pprotein;称取蛋白纯品,配制成标准蛋白母液,计算其浓度;(4)对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定,得到样品中目标蛋白的粗测浓度c1;(5)对样品中的蛋白进行酶切,根据目标蛋白的粗测浓度c1,添加适量的同位素标记特异性肽段,并以合成的非标记特异性肽段为标准,采用同位素稀释质谱法对样品酶解液中特异性肽段浓度进行测定,浓度测定结果为cpeptide;(6)根据粗测浓度c1,在质量为w0的样品中添加浓度为c0或其稀释液的待测蛋白母液质量w1,使其浓度略有增加,添加后的浓度与添加前的浓度处于同一个数量级;接着按照步骤(5)对添加后的样品进行酶切和特异性肽段浓度的同位素稀释质谱测定,测定结果为cpeptide1;(7)根据测定的酶解液中特异性肽段的浓度,计算蛋白浓度;(8)计算添加蛋白母液质量w1时的酶切效率;(9)重复步骤(6)到步骤(8)的过程,每次添加不同的蛋白量,得到一系列的酶切效率值ηn;(10)以蛋白添加质量浓度为横轴、酶切效率为纵轴作图,通过拟合得到酶切效率与蛋白添加量的关系图,将蛋白添加量外推至0,得到原始样品中蛋白质的准确酶切效率。2.根据权利要求1所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(1)中所述蛋白酶为胰蛋白酶或Glu-C。3.根据权利要求2所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(3)中所述标准蛋白母液的浓度通过公式二计算;式中,c0——蛋白母液浓度,单位g/g;m——称取的蛋白纯品的质量,单位g;w——溶液的质量,单位g;Pprotein——目标蛋白的质量分数。4.根据权利要求3所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(4)中对待测基质样品中的目标蛋白浓度进行初步测定的方法采用ELISA、HPLC或HPLC-MS方法。5.根据权利要求4所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(5)中cpeptide的计算通过公式三进行:式中,Ppeptide——非标记肽段的质量分数,单位g/g;ms——样品中添加的同位素标记肽段的质量,单位g;Rs——样品分析结果中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;I1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;I2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的质量比;R1——高标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;R2——低标中非标记肽段和同位素标记肽段的峰面积比;ws——称取的样品质量,单位g。6.根据权利要求5所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(7)蛋白浓度的计算采用公式四和公式五分别计算蛋白的浓度;由肽段浓度cpeptide计算的蛋白浓度为cprotein,由肽段浓度cpeptide1计算的蛋白浓度为cprotein1;式中,cpeptide——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,单位g/g;cpeptide1——通过同位素稀释质谱法测定的酶解液中特异性肽段的浓度,与cpeptide的数值不同,单位g/g;cprotein——当肽段浓度为cpeptide时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;cprotein1——当肽段浓度为cpeptide1时酶解液中未经酶解效率校正时的蛋白质浓度,单位g/g;Mprotein——目标蛋白的分子量;Mpeptide——特异性肽段的分子量;n——一个目标蛋白中含有的特异性肽段的个数,n=1。7.根据权利要求6所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法,其特征在于:步骤(8)中酶切效率的计算采用公式六进行:式中,η1——添加蛋白母液质量w1时的酶切效率;w0——样品质量,单位g;w1——蛋白母液质量,单位g;cprotein1——添加后样品采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;cprotein——未添加时采用同位素稀释质谱测定的样品中蛋白浓度,单位g/g;c0——蛋白质母液的浓度,单位g/g。8.采用权利要求7所述的基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法测定奶粉中β-乳球蛋白酶切效率,其特征在于:包括如下步骤:(1)通过生物信息学的手段进行数据库检索,选择TPEVDDEALEK,即TK-11作为β-乳球蛋白同位素稀释质谱定量的特异性肽段;(2)采用氨基酸固相合成手段,合成出肽段TK-11,以及同位素氨基酸标记的肽段TK*-11,通过反相高效液相色谱手段进行纯化,使其反相高效液相色谱纯度达到99%以上;以国家缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸有证标准物质为标准,以同位素标记缬氨酸、脯氨酸和亮氨酸为内标,采用同位素稀释质谱法对合成的标准肽段进行准确定量,得到合成肽的质量分数为0.786g/g;(3)获取纯化后的β-乳球蛋白,并采用基于氨基酸分析的同位素...
【专利技术属性】
技术研发人员:武利庆,金有训,高运华,李佳乐,杨彬,
申请(专利权)人:中国计量科学研究院,
类型:发明
国别省市:北京;11
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