抗真菌植物蛋白质、肽和使用方法技术

提供表达MtDef5抗真菌蛋白质和肽的，展现对易感真菌的高抗性水平的转基因植物。所述转基因植物含有包含可操作地连接于编码这些分子的核酸序列的天然或异源性信号肽序列的重组DNA构建体。也提供产生所述植物的方法；保护植物免遭易感真菌性感染和损害的方法；以及可施用于植物的场所，包含表达这些分子的微生物或这些分子自身的组合物；以及含有这些分子的药物组合物。本发明专利技术也涵盖MtDef5抗真菌蛋白质和肽治疗易感真菌性感染的人和兽医学治疗用途。

Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use

Transgenic plants expressing MtDef5 antifungal proteins and peptides that exhibit high levels of resistance to susceptible fungi. The transgenic plants contain recombinant DNA constructs comprising a natural or heterologous signal peptide sequence operably linked to nucleic acid sequences encoding these molecules. A method for producing said plant is also provided; susceptibility to fungal infection and protect plants from damage; and can be applied to the plant sites, compositions containing these molecules of these microorganisms or the molecules themselves; and pharmaceutical compositions containing these molecules. The present invention also relates to the therapeutic use of MtDef5 antifungal proteins and peptides for the treatment of susceptible fungal infections in human and veterinary medicine.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年4月30日提交的美国临时申请序列号61/817,415的优先权权益，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。专利技术背景专利
本专利技术涉及源于蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(BarrelMedic、BarrelMedick或BarrelClover)的抗真菌小蛋白质和肽，即MtDef5防御素(Defensin)；以及用于控制易感于这些分子的抗真菌活性的病原性真菌的方法。抗真菌蛋白质和肽可作为抗真菌组合物的组分直接施用于植物，以产生蛋白质或肽的微生物形式施用于植物，或植物自身可被遗传修饰以产生蛋白质或肽。本专利技术也涉及适用于控制病原性植物和其它真菌的DNA构建体、微生物、和用DNA构建体转化的植物、以及组合物。相关技术的描述保护在农业上重要的作物免遭病原性真菌在改进作物产量方面是至关重要的。真菌性感染是潮湿气候下的特定问题，并且可变为作物储存期间的主要关心问题，其中所述感染可导致粮食或饲料产品腐败以及被真菌毒素污染。不幸的是，现代生长方法以及收获和储存系统可促进植物病原体感染。控制植物病原体因需要同时控制多种不同属真菌而进一步复杂。举例来说，如链格孢属(Alternaria)；曲霉属(Aspergillus)；壳二孢属(Ascochyta)；葡萄孢属(Botrytis)；尾孢属(Cercospora)；刺盘孢属(Colletotrichum)；色二孢属(Diplodia)；白粉菌属(Erysiphe)；镰刀菌属(Fusarium)；顶囊壳属(Gaeumanomyces)；长蠕孢属(Helminthosporium)；壳球孢属(Macrophomina)；丛赤壳属(Nectria)；霜霉属(Peronospora)；层锈菌属(Phakopsora)；茎点霉属(Phoma)；瘤梗孢属(Phymatotrichum)；疫霉属(Phytophthora)；单轴霉属(Plasmopara)；叉丝单囊壳属(Podosphaera)；柄锈菌属(Puccinia)；腐霉属(Pythium)；核腔菌属(Pyrenophora)；梨孢属(Pyricularia)；丝核菌属(Rhizoctonia)；小菌核属(Scerotium)；核盘菌属(Sclerotinia)；壳针孢属(Septoria)；根串珠霉属(Thielaviopsis)；钩丝壳属(Uncinula)；黑星菌属(Venturia)；和轮枝孢菌属(Verticillium)物种的真菌是所有认定的植物病原体。因此，仅控制一子组有限真菌病原体的抗性作物植物种类或杀真菌剂在其中存在多种病原体的条件下可能不能递送充分保护。进一步预期植物病原性真菌可变得对现存杀真菌剂以及转基因和非转基因作物种类具有抗性，从而使得必须引入具有用以抗击抗性真菌的不同作用模式的真菌控制剂。一种用以抑制植物病原性真菌活性的方法已在于鉴定和分离展现针对植物病原性真菌的抗真菌活性的肽、多肽和蛋白质(Bowles,1990；Brears等,1994)。包括几丁质酶(chitinase)、富含半胱氨酸的几丁质结合蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、permatin(包括zeamatin)、硫素(thionin)、核糖体失活蛋白和非特异性脂质转移蛋白的抗真菌肽、多肽和蛋白质据信在针对真菌性感染的植物防御中起重要作用。在转基因植物中使用这些蛋白质产物来控制植物病原体已例如报道于欧洲专利申请0392225中。称为防御素的另一组肽已显示会抑制植物病原体。防御素是具有45-54个氨基酸的富含半胱氨酸的小肽，其构成植物的先天免疫性的重要组分(Thomma等,2002；Lay和Anderson,2005)。在植物中广泛分布，防御素在它们的氨基酸组成方面极大变化。然而，它们都具有通过四个或五个分子内二硫键来稳定的紧实形状。已充分研究植物防御素在植物防御中的作用。一些植物防御素在微摩尔浓度下抑制广泛范围的真菌的生长(Broekaert等,1995；Broekaert等,1997；daSilvaConceicao和Broekaert,1999)，并且当在转基因植物中表达时赋予对真菌病原体的强烈抗性(daSilvaConceicao和Broekaert,1999；Thomma等,2002；Lay和Anderson,2005)。当添加纯蛋白质至体外抗真菌测定培养基中时，两种从萝卜种子分离的富含半胱氨酸的小蛋白质Rs-AFP1和Rs-AFP2抑制许多病原性真菌的生长(美国专利号5,538,525)。发现含有编码Rs-AFP2蛋白的基因的转基因烟草植物比非转化植物对真菌攻击具有更大抗性。抗真菌防御素蛋白也已在苜蓿(紫苜蓿(Medicagosativa))中被鉴定，并且在体外测试中以及在转基因植物中均显示会抑制植物病原体，如镰刀菌属和轮枝孢菌属(美国专利号6,916,970)。在低盐体外测定条件下，苜蓿防御素AlfAFP1在1μg/ml下使大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)生长抑制50％，并且在4μg/ml下使大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)生长抑制50％(即IC50值分别是1μg/ml和4μg/ml)。在转基因马铃薯植物中表达AlfAFP1蛋白也在温室测试与田地测试两者中均显示会赋予对大丽花轮枝孢的抗性(Gao等,2000)。作用模式分析也已显示AlfAFP1(其或者被称为代表紫苜蓿防御素1(MedicagosativaDefensin1)的MsDef1)诱导禾谷镰刀菌(F.graminearum)高度分支，并且可阻断L型钙通道(Spelbrink等,2004)。其它防御素基因也已在豆科植物蒺藜苜蓿中被鉴定(Hanks等,2005)。已通过体外实验证明克隆的MtDef2蛋白具有少许或不具有抗真菌活性(Spelbrink等,2004)。序列数据库搜索分析鉴定与已知苜蓿属防御素基因具有同源性的10个假定共有序列(由多个EST表示的10个独特防御素编码基因)和6个单例(即由单一EST表示的6个独特防御素基因)。一个假定共有序列被鉴定为TC85327，并且显示在模拟处理的蒺藜苜蓿根与菌根真菌感染的蒺藜苜蓿根两者中均表达。在这个研究中不存在由任何TC85327蒺藜苜蓿序列编码的蛋白质具有抗真菌活性的证明(Hanks等,2005)。尽管如AlfAFP1(MsDef1)和Rs-AFP2的防御素蛋白已用于获得对真菌性感染具有抗性的转基因植物，但需要提供抗性水平增加的其它蛋白质。具体来说，针对真菌病原体的特异性活性增加的蛋白质将特别适用于改进在转本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的纯化蛋白质或肽，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、3‑9、16‑22、和49‑64中所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.30 US 61/817,4151.一种分离的纯化蛋白质或肽，其包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少
90％序列同一性的氨基酸序列：SEQIDNO:1、3-9、16-22、和49-64中所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的纯化蛋白质或肽，其在它的N末端包含植物质外体、液泡
或内质网靶向氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的分离的纯化蛋白质或肽，其中所述靶向序列包含与选自由以下
组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQIDNO:30-35和42-48
中所示的氨基酸序列。
4.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求1至3中任一项的所述分离的纯化蛋白质或
肽。
5.如权利要求4所述的分离的核苷酸序列，其针对在目标植物中表达加以密码子优化。
6.如权利要求4或5所述的分离的核苷酸序列，其中所述目标植物是粮食作物植物。
7.如权利要求6所述的分离的核苷酸序列，其中所述粮食作物植物选自由以下组成的
组：大豆、小麦、玉米、甘蔗、稻和马铃薯。
8.一种转基因植物，其细胞含有包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少
90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质或肽：SEQIDNO:1、3-9、16-22、和49-64中所示的
氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的转基因植物，其中所述蛋白质或肽在它的N末端进一步包含植物
质外体、液泡或内质网靶向氨基酸序列。
10.如权利要求8或9所述的转基因植物，其基因组进一步包含：
编码选自由MsDef1、MtDef2、MtDef4、NaD1、Rs-AFP1、Rs-AFP2、KP4和KP6组成的组的植
物防御素的DNA，其中所述DNA被表达，并且产生抗真菌有效量的所述防御素，和/或
编码苏云金杆菌内毒素的DNA，其中所述DNA被表达，并且产生抗昆虫有效量的所述苏
云金杆菌内毒素，和/或
编码对所述植物赋予除草剂抗性的蛋白质的DNA，其中所述DNA被表达，并且产生抗除
草剂有效量的赋予除草剂抗性的所述蛋白质。
11.一种组合物，其包含含有与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少90％序列
同一性的氨基酸序列的蛋白质或肽及其任何组合：SEQIDNO:1、3-...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·沙，
申请(专利权)人：唐纳德丹佛斯植物科学中心，
类型：发明
国别省市：美国;US