测定MPO卤化酶活性的方法技术

一种测定MPO卤化酶活性的方法，本发明专利技术的目的是用离子层析法从HL‑60细胞中分离出具有自然蛋白结构和酶活性MPO，建立测定MPO卤化酶活性方法，用纯化MPO作为校准品，测定人血清/浆中MPO卤化酶活性单位。本发明专利技术测定的MPO卤化酶从HL‑60细胞中分离。本发明专利技术建立NaI‑TMB（3,3’,5,5’‑tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺）法，直接测定血清/浆中MPO卤化酶活性，用于预测心脑血管疾病发生可能性及疾病预后。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及自然蛋白酶纯化方法。
技术介绍
髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的糖基化并含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。人体粒细胞进入循环之前，在骨髓内合MPO成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放MPO。在成熟的粒细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)中，MPO是含量最丰富的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞(PMNs)内总蛋白质含量的5%，血液中95%的MPO来源于PMNs髓过氧化物酶（MPO）是由2个亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(α链，466个氨基酸残基）和一条轻链(β链，108个氨基酸残基)所构成。2个亚单位在α链处由1个二硫键相连。重链具有亚铁卟啉基团，表明MPO是铁依赖性氧化物酶。MPO基因位于染色体17q23q24，含有12个外显子和11个内含子，长约14638bp，调控其基因表达的是生长因子。MPO的mRNA在早幼粒细胞的表达水平最高，其次是原始粒细胞、幼稚和原始单核细胞；当细胞分化到成熟时期，MPO基因表达水平迅速下降。现已知MPO基因首先表达是一条相对分子质量为84KDa前体MPO蛋白，经过翻译后加工，切割成α和β两种亚基，再聚合为成熟的MPO分子，加上糖链，最后形成糖基化，有酶活性MPO。MPO一个重要特征是等电点（pI）很高，为9.2。过氧化氢（H2O2）氧化MPO后，成为氧化型MPO，具有氧化酶和卤化酶活性，MPO酶活性最佳pH为4.5～5.5，当pH≥10，或≤2时，丧失MPO酶活性。MPO的主要功能是在吞噬细胞内杀灭微生物，利用H2O2和氯离子（Cl-）产生次氯酸盐（HOCl），并形成具有氧化能力的自由基，构成MPO–H2O2–卤素系统。许多研究发现，MPO不仅能杀灭吞噬于细胞内的微生物，而且可释放到细胞外，破坏多种靶物质，如肿瘤细胞、血小板、NK细胞等，对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。然而，在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化剂(HOCl等)，超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化性组织损伤，如血管内皮层部位炎症反应和血管内皮层细胞损伤和死亡。动脉粥样硬化是形成心脑血管疾病的重要病理基础。研究表明，动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应性疾病，而MPO作为炎性因子，在动脉粥样斑块形成的起始、发展、破裂及脱落等过程中起着重要作用。研究发现，血液中MPO，结合血管内皮细胞，侵润到血管内皮基下层，通过MPO酶氧化反应，直接消耗内皮细胞产生信号分子NO，降低激活鸟苷酸活化酶功能，从而引发血管内皮舒张功能障碍。MPO在体内产生可扩散的氧化剂(HOCl)，促进氧化LDL（oxLDL）产生，oxLDL更易被巨噬细胞吞噬，转化为泡沫细胞，沉积在血管内膜下，从而促进动脉粥样硬化斑块形成；HOCl可激活基质金属蛋白酶原（MMPs），使基质蛋白聚糖降解，导致动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄，斑块表面腐蚀，破裂和血栓的形成，导致动脉粥样硬化斑块不稳定。HOCl能诱导血管内皮细胞产生P选择素和组织因子表达，促进血小板聚集，从而导致血栓的形成。可见，MPO对血管内皮细胞功能障碍的早期，到粥样硬化斑块的形成，及随后斑块破裂和血栓的形成整个过程起了关键性作用，最终导致冠状动脉痉挛，心绞痛，甚至心肌梗死的发生。研究发现，血液中MPO作为一种炎症标记物，测定血液中MPO酶活性或浓度；（1）能作为动脉粥样斑块不稳定性早期预测指标（1）能用于急性冠脉综合征（CVD）的早期诊断，评估CVD病情和预后：（3）能用于预测健康人群发生心脑血管疾病的危险性。另外，人体血液中高浓度MPO与人类多种疾病的发生、发展密切相关，神经炎症疾病方面包括：多发性硬化症，阿尔茨海默氏症，帕金森氏症等。其它炎性疾病如：慢性阻塞性肺病，囊肿性纤维化，肾小球损伤和类风湿关节炎等。测定血液中MPO酶活性或浓度能对这些疾病的预防，诊断，和治疗有很大帮助。在临床检验中，检测血液中MPO浓度方法主要是酶联免疫法（ELISA）及直接测定血液MPO酶活性方法，两个测定方法都需要纯化MPO作为校准品，此校准品要有MPO自然蛋白结构和酶活性。MPO基因首先表达出一条分子质量为84KDa前体MPO蛋白，经过翻译后加工，切割成α和β两种亚基，再聚合为成熟的MPO分子，进一步糖基化，最后形成有酶活性糖化MPO。获得纯化MPO方法一是从人体血液分离出白细胞，再从这些细胞中大量提取自然MPO。这种方法缺点，一是血液来源受限制，二是血液中有多种感染因子，制备出MPO校准品不安全。另一方法是用基因工程法在人体细胞内表达MPO，但表达后MPO不能进行有效蛋白加工，不能进行正确糖基化，重组MPO蛋白有很弱酶活性，不宜作为MPO校准品。目前，国内外已有检测血液中MPO的试剂盒，主要采用ELISA，此法简单，易操作，得到广泛应用。但这种方法测定血液中MPO的含量，间接表明血液中MPO酶活性，有时MPO含量与MPO酶活性是不相关，如MPO基因变异人群及血液中有MPO抑制物的人群；另外，制备测定MPOELISA试剂盒需要几种MPO单克隆抗体，制备成本高，时间长；同时，ELISA法步骤多，需要时间较长，准确性差等缺点。而动脉硬化活动状况与血液中MPO卤化酶活性相关性最大，测定血液中MPO卤化酶活性最能代表动脉硬化活动状况。
技术实现思路
本专利技术的目的是用离子层析法从HL-60细胞中分离出具有自然蛋白结构和酶活性MPO，建立测定MPO卤化酶活性方法，用纯化MPO作为校准品，测定人血清/浆中MPO卤化酶活性单位。本专利技术测定的MPO卤化酶从HL-60细胞中分离的步骤是：a、从HL-60细胞中分离出MPO：培养HL-60细胞,离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液溶解细胞，再进一步用Douncehomogenization破裂细胞，离心，收集细胞沉积物，细胞沉积物中含MPO；b、1%CTAB-磷酸盐缓冲液溶解上述细胞沉积物中MPO；c、制备Q-Sepharose层析柱：用0.5%CTAB-磷酸盐缓冲液平衡Q-Sepharose层析柱，上述MPO溶解液通过Q-Sepharose层析柱，结合蛋白到Q-Sepharose层析柱上，收集滤过液，滤过液含有pI=9.2的MPO；d、制备SP-Sepharose层析柱：用0.2%CTAB-磷酸盐溶液平衡SP-Sepharose层析柱，上述含有MPO滤过液通过SP-Sepharose层析柱，pI≥8.0蛋白结合到SP-Sepharose层析柱上，用600mMK2PO4-磷酸盐缓冲液洗脱SP-Sepharose层析柱结合蛋白，收集含有MPO的洗脱液；e、放上述洗脱液至蛋白透析袋中，用150mMNaCl-磷酸盐缓冲液透析；f、制备ConA-Sepharose4B层析柱：用100mMNaCl-磷酸盐溶液洗涤ConA-Sepharose4B,再与透析后蛋白液混合，ConA-Sepharose4B结合糖化MPO，用500mMNaCl-磷酸盐缓冲液洗涤ConA-Sepharose4B层析柱，用600mMa-D-methylmannoside-磷酸盐缓冲液洗脱ConA-Sepharose4B层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定MPO卤化酶活性的方法，其特征在于：测定的MPO卤化酶从HL‑60细胞中分离的步骤是：a、从HL‑60细胞中分离出MPO：培养HL‑60细胞, 离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液溶解细胞，再进一步用Dounce homogenization 破裂细胞，离心，收集细胞沉积物，细胞沉积物中含MPO；b、1% CTAB‑磷酸盐缓冲液溶解上述细胞沉积物中MPO；c、制备Q‑Sepharose 层析柱： 用0.5% CTAB‑磷酸盐缓冲液平衡Q‑Sepharose 层析柱，上述MPO溶解液通过Q‑Sepharose 层析柱，结合蛋白到Q‑Sepharose 层析柱上，收集滤过液，滤过液含有pI=9.2的MPO；d、制备SP‑Sepharose 层析柱：用0.2% CTAB‑磷酸盐溶液平衡SP‑Sepharose 层析柱，上述含有MPO滤过液通过SP‑Sepharose 层析柱，pI≥8.0蛋白结合到SP‑Sepharose 层析柱上，用600mM K2PO4‑磷酸盐缓冲液洗脱SP‑Sepharose 层析柱结合蛋白，收集含有MPO的洗脱液；e、放上述洗脱液至蛋白透析袋中，用150mM NaCl‑磷酸盐缓冲液透析；f、制备ConA‑Sepharose4B 层析柱：用100mM NaCl‑磷酸盐溶液洗涤ConA‑Sepharose4B,再与透析后蛋白液混合，ConA‑Sepharose4B结合糖化MPO，用500mM NaCl‑磷酸盐缓冲液洗涤ConA‑Sepharose4B 层析柱，用600mM a‑D‑methylmannoside ‑磷酸盐缓冲液洗脱ConA‑Sepharose4B 层析柱结合糖化蛋白，收集含有MPO的洗脱液；g、放上述洗脱液至蛋白透析袋中，用150mM NaCl‑磷酸盐缓冲液透析, 收集蛋白液，分装，放‑80°C 冻存。...

【技术特征摘要】
1.一种测定MPO卤化酶活性的方法，其特征在于：测定的MPO卤化酶从HL-60细胞中分离的步骤是：a、从HL-60细胞中分离出MPO：培养HL-60细胞,离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液溶解细胞，再进一步用Douncehomogenization破裂细胞，离心，收集细胞沉积物，细胞沉积物中含MPO；b、1%CTAB-磷酸盐缓冲液溶解上述细胞沉积物中MPO；c、制备Q-Sepharose层析柱：用0.5%CTAB-磷酸盐缓冲液平衡Q-Sepharose层析柱，上述MPO溶解液通过Q-Sepharose层析柱，结合蛋白到Q-Sepharose层析柱上，收集滤过液，滤过液含有pI=9.2的MPO；d、制备SP-Sepharose层析柱：用0.2%CTAB-磷酸盐溶液平衡SP-Sepharose层析柱，上述含有MPO滤过液通过SP-Sepharose层析柱，pI≥8.0蛋白结合到SP-Sepharose层析柱上，用600mMK2PO4-磷酸盐缓冲液洗脱SP-Sepharose层析柱结合蛋白，收集含有MPO的洗脱液；e、放上述洗脱液至蛋白透析袋中，用150mMNaCl-磷酸盐缓冲液透析；f、制备ConA-Sepharose4B层析柱：用100mMNaCl-磷酸盐溶液洗涤ConA-Sepharose4B,再与透析后蛋白液混合，ConA-Sepharose4B结合糖化MPO，用500mMNaCl-磷酸盐缓冲液洗涤ConA-Sepharose4B层析柱，用600mMa-D-methylmannoside-磷酸盐缓冲液洗脱ConA-Sepharose4B层析柱结合糖化蛋白，收集含有MPO的洗脱液；g、放上述洗脱液至蛋白透析袋中，用150mMNaCl-磷酸盐缓冲液透析,收集蛋白液，分装，放-80°C冻存。2.根据权利要求1所述测定MPO卤化酶活性的方法，其特征在于：冻存的蛋白液采用银染法测定MPO纯度，a、冻存蛋白液离心管放到37°水浴中，快速溶化，放到冰块中；b、10ul蛋白液,加4ul4X蛋白加样液，100°，3分钟，其中样液是50mMTris，pH6.8，2%SDS，10%Glycerol，1%β-mercaptoethanol，12.5mMEDTA，0.02%Bromophenolblue；c、加10ul蛋白液样本液10%SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳；d、完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶，进行银染色，步骤如下：①加100ml50%Methanol到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除Methanol液体；②加100ml5%Methanol到SDS...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜培革，李宝民，刘斌，关大伟，赵雪，隋宝真，王玉华，史永丰，王贺，关恒，安丽萍，苑广信，王曼力，林林，
申请(专利权)人：长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22