一种提高α半乳糖甘酶活性的方法技术

本发明专利技术的一种提高alpha半乳糖苷酶活性的方法，包括以下步骤：将α半乳糖苷酶基因(Genbank号：X03102)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号：M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号：AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端：GAL1启动子+MFα1信号肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明专利技术的优点：将α半乳糖苷酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高α半乳糖苷酶活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达α半乳糖苷酶以提高该酶活性的方法。
技术介绍
饲料中含有水苏糖等含α半乳糖苷的动物肠道消化酶难以消化的糖类，不仅影响动物对碳水化合物的消化吸收，而且会提高单胃动物消化道粘度，妨碍动物肠道消化酶对饲料中其它营养成分的消化吸收。在饲料中添加α半乳糖苷酶可望有效去除水苏糖等对动物消化功能的不利影响。但目前已研制成功的α半乳糖苷酶主要存在以下问题酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达。细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率。分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。
技术实现思路
针对现有α半乳糖苷酶催化效率低的问题，本专利技术提供一种将α半乳糖苷酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面的技术，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高 α半乳糖苷酶活性。本专利技术的一种提高alpha半乳糖苷酶活性的方法，包括以下步骤将α半乳糖苷酶基因(Genbank号30310 连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号 Μ28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(Genbank号ΑΥ428072)下游 MFa 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1 启动子+MFa 1信号肽序列+ α半乳糖苷酶基因+ α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。将包含上述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有7% (重量百分比)半乳糖和 2. 5-5%乳糖(重量百分比)的YPD培养基中。本专利技术的优点将α半乳糖苷酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外底物的完全接触，从而显著提高α半乳糖苷酶活性。具体实施例方式以下通过实施例进一步对本专利技术进行描述实施例1 α半乳糖苷酶展露表达将α半乳糖苷酶基因(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank3号30310 连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(来自酿酒酵母Mccharomyces cerevisiae, Genbank号iC8164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(来自酿酒酵母表达载体PYES263，Genbank号AY428072)下游MFa 1信号肽序列(来自酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae, Genbank 号M17301)的 C 端，构建成表达框(从 N 端到 C 端)GAL1启动子+MFal信号肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)，则MFal信号肽将引导α半乳糖苷酶向酿酒酵母细胞外分泌，而α半乳糖苷酶下游的α凝集素则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使α半乳糖苷酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。实施例2 α半乳糖苷酶展露表达的诱导在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加7 %半乳糖(购自上海生工生物工程有 P艮公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & ServicesCo.， Ltd.)和2. 5-5%乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai SangonBiological Engineering Technology & Services Co.，Ltd.)，则表达框 “GAL1 启动子+MFa 1 信号肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素”中的GALl启动子就会活化，诱导α半乳糖苷酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。实施例3半乳糖和乳糖对α半乳糖苷酶展露表达的作用在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖和乳糖，则未检测到α半乳糖苷酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+ α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl启动子无法保持活化状态。实施例4 α半乳糖苷酶展露表达后活性的提高按照实施例1和实施例2所示步骤进行展露表达的α半乳糖苷酶活性为974U/ mL(7%半乳糖和2. 5%乳糖)和892U/mL(7%半乳糖和5%乳糖)，而如果在实施例1和实施例2所示的展露表达表达框“GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+ α半乳糖苷酶基因+ a 凝集素”中去除α凝集素序列，则α半乳糖苷酶进行分泌表达，活性为273U/mL(7%半乳糖和2. 5%乳糖)和沈卯/11^(7%半乳糖和5%乳糖)。因此，在表达系统与基本表达元件一样的情况下，增加α凝集素这一展露表达元件可使α半乳糖苷酶活性提高数倍。α半乳糖苷酶活性单位U定义为在37°C、pH 5. O的条件下，1分钟内从0. 01摩尔 / 升的 pNPG(p-nitrophenyl-alpha-D-galactopyranoside，购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology &Services Co.，Ltd.)溶液中释放出1微摩尔pNP(p-nitrophenyl p-nitrophenyl，购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological EngineeringTechnology & Services Co.，Ltd. ) ^fff 要的α半乳糖苷酶酶量为IU。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本专利技术的具体实施例子。显然，本专利技术不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本专利技术公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本专利技术的保护范围。权利要求1.，其特征在于包括以下步骤将α半乳糖苷酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl 启动子下游MF α 1信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子 +MFa 1信号肽序列+ a半乳糖苷酶基因+ α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有重量百分比7 %半乳糖和重量百分比2. 5-5 %乳糖的YPD培养基中。全文摘要本专利技术的一种提高alpha半乳糖苷酶活性的方法，包括以下步骤将α半乳糖苷酶基因(Genbank号X03102)连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列(Genbank号M28164)的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GAL1启动子(Genbank号AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MFα1信号肽序列+α半乳糖苷酶基因+α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本专利技术的优点将α半乳糖苷酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面，实现酶与细胞外本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种提高α半乳糖甘酶活性的方法，其特征在于包括以下步骤：将α半乳糖苷酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份α凝集素序列的Ｎ端，然后插入酿酒酵母表达载体ＧＡＬ１启动子下游ＭＦα１信号肽序列的Ｃ端，构建成表达框，表达框从Ｎ端到Ｃ端：ＧＡＬ１启动子＋ＭＦα１信号肽序列＋α半乳糖苷酶基因＋α凝集素序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阮晖，陈美龄，马风兰，陈赟，廖文艳，徐娟，王睿之，周陈伟，何国庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86