在生物介质中测定酶活性的方法技术

本发明专利技术提供了可靠、快速和方便的方法，在信号底物的存在下即 时测定生物学介质中酶浓度的变化，其中对底物的消耗、信号的颜色 依赖性以及信号底物的离去基团浓度与信号量之间的非线性进行了校 正。该方法包括在适当的介质例如缓冲液中测量校正曲线，以确定被 测量的曲线的特征。然后，这些特征允许在出现酶生成的介质的样品 中，通过基于单点测定的数学方法，再次获得该完整的曲线或足够部 分的曲线。该方法的大优点是不需要在每个个体介质中测量整个校正 曲线，因为单点测定就已足够。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术属于诊断学领域，并具体涉及在血液和其它流体中测定蛋白水解酶例如凝血酶的生物学活性形式的新方法，以及执行该方法的测试试剂盒。专利技术背景生物化学、化学、医学、诊断学等领域的许多实验室都对测定生物介质中产生的酶感兴趣。为此，通常使用释放发色团或荧光团的信号底物，因此在转化后将产生可以即时(in time)跟踪和测量的产色或荧光信号。在生物介质中即时跟踪酶的形成的方便方法是将底物直接加入到生物介质中，例如将荧光底物加入到其中形成了凝血酶的凝固血浆中。其优点是酶的生成在其生理介质中被测定。该方法的缺点是，酶对于任何也可存在于该介质中的生理底物的活性将与加入的信号底物发生竞争，并且在酶的生成完成之前，底物可能完全消耗了。为了最小化这些影响，通常选择那些与酶的结合不是太紧密(即KM低)并且转化不是太快(即kcat低)的底物。另一个问题是被测量的信号通常依赖于发生反应的介质的浊度和颜色。因此，来自不同来源或供体的介质中同样的酶量可能产生不同的信号量。此外，发色团或荧光团的浓度可能不与信号的量直接成比例。这使得在反应的时程期间计算存在的酶的量更加困难。为了即时精确定量酶浓度，所有这些影响都必须纳入考虑。-->WO 03/093831公开了在血液或血浆样品中实时测定样品中的蛋白水解活性、特别是凝血酶活性在样品出现并消失的过程的方法，该方法包括在样品中加入凝血酶底物，在每单位时间产生可检测的信号，信号的量与凝血酶的存在量具有相关性。同时，在没有触发凝血酶生成的同样血液或血浆的对照样品中，测定了具有恒定凝血酶活性的标准制备物的活性。通过将在凝固的血液中测量到的活性与同时测量的校正物获得的校正曲线进行比较，获得了在任何时候存在的凝血酶的准确摩尔量。该专利还公开了如果介质的颜色对信号有影响，那么该校正曲线最好在使用的每种颜色的介质中测定。在不同颜色或浊度的另一种介质中测量同样量的校正的酶的方法将产生非常相似的校正曲线，除了所谓的介质依赖性效应之外。本专利技术提供了可选的方法，其中该校正曲线在一种介质中仅测量一次，在不同颜色或浊度的相似介质中的测定不再通过测量全部曲线来进行，而是可以用“单点”测定来代替。专利技术简述根据本专利技术，提供了在凝固的血浆中测定即时的凝血酶过程的方法，包括下列步骤：a)将信号底物加入到含有预定量凝血酶活性的反应混合物中，所述信号底物在与所述凝血酶活性反应后，产生了与形成的转化产物相关的可检测信号；b)通过数学方法确定步骤a)中的即时信号曲线特征，以便计算曲线的起始斜率，并对其曲率进行估算；c)在其中出现凝血酶生成的血浆中加入信号底物，所述信号底物在与凝血酶反应后产生与形成的转化产物相关的可检测信号；d)向同样的样品或与其中出现凝血酶生成的相同血浆的另一个样品中加入荧光化合物，提供了可检测的信号，用作血浆引起的浊度和/或颜色对信号的影响的度量；-->e)将步骤d)中的测量结果与步骤a)中的测量结果进行比较，以建立一种关系，用于校正其中出现凝血酶生成的血浆的浊度和颜色；以及f)使用在步骤b)中测定的1)的测量结果曲率来校正测量信号的系统的非线性，并使用从步骤b)得到的起始斜率从步骤c)中测量的信号来计算即时的凝血酶的浓度。本专利技术还提供了用于执行权利要求1的方法的试剂盒，其包括下面的成分：-已知浓度的被测酶或与被测酶对信号底物的酶活性类似的化合物。-启动酶生成的触发试剂。-促进测试的诊断值的添加物。-能够用于标准化和/或对照的血浆。-试剂，含有信号底物或待添加产生信号的离去基团的信号底物。-可直接加载到计算机的内存中的软件程序，当所述程序在计算机中运行时，用于计算通过本文公开的方法测定的酶活性。-指导手册。-校正量的荧光团，其在其中出现酶生成的介质的内部或外部使用。-荧光源，其可以在其中出现酶生成的介质的内部或外部使用。第一个生物学样品通常选自血液、血浆包括富血小板、贫血小板或无血小板的血浆、唾液、血清、尿液、脑脊液、精液和粪便。当对血液样品执行本专利技术的方法时，血液通常被收集在含有柠檬酸钠或EDTA等的试管中，以便结合血液中游离的钙离子被，阻止凝血酶形成和凝血。因此，为了启动凝血酶生成，应该在开始测量前不久加入钙。但是，在血液没有被收集在柠檬酸钠等中的情况下，添加钙可能不是必需的。例如，当使用该方法时的途径可以在取得血液后-->几分钟内开始实验。待测的蛋白水解活性通常选自活化的凝血因子活性包括凝血酶、活化的纤溶因子活性、以及补体系统活化成分的活性。优选的实施方案是按照本专利技术的方法，从血液或血浆样品实时测定凝血酶的活性过程。在本方法中使用的信号底物优选选自含有离去基团的化合物，所述离去基团在被形成的蛋白水解酶反应后给出可检测的转化产物。该转化产物通常通过分光术、特别是荧光(优选)、光密度以及NMR来测定。因此，所述离去基团通常是荧光基团、发色基团、释放氢离子的基团等。用于执行本专利技术方法的适合和优选的信号底物是Z-Gly-Gly-Arg-AMC。此外，适合的可检测转化产物包括对-硝基苯胺和7-氨基-4-甲基-香豆素。用于执行上述本专利技术方法的具有熟知的稳定蛋白水解活性的适合工具包括α2-巨球蛋白-凝血酶复合物(优选)、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物以及γ-凝血酶。此外，任何其二级识别位点被修饰、使得其活性中心保留完整、但与反应混合物中的蛋白的功能性相互作用被废止的蛋白水解酶，都可以使用。执行本方法的有用的蛋白酶激活剂包括钙离子、磷脂、组织因子、可溶性组织因子、促凝血酶原激酶、高岭土和鞣花酸(elagic acid)。按照本专利技术的另一方面，所述第一个生物学样品还含有要测定其对研究中的蛋白水解系统、例如止血-凝血系统的影响的药剂。可以在本方法中测试的适合的药剂是抗血栓剂例如抗血小板剂和抗凝血剂，例如肝素、硫酸皮肤素，直接凝血酶抑制剂例如水蛭素、阿加曲班(argatroban)或美拉加群(melagatran)，以及因子Xa抑制剂例如厚抗凝蛋白(thick anticoagulant protein)。-->本专利技术的这些以及其它的目的将在下面更详细地解释。附图简述图1显示了含有凝血酶和信号底物的反应混合物的即时信号。图2显示了缓冲液和血浆中荧光团(氨基甲基香豆素，AMC)的浓度范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
在凝固的血浆中测定即时的凝血酶过程的方法，其包括下列步骤：　ａ）将信号底物加入到含有预定量凝血酶活性的反应混合物中，所述信号底物在与所述凝血酶活性反应后，产生与所形成的转化产物相关的可检测信号；　ｂ）通过数学方法确定步骤ａ）中的 即时信号曲线的特征，以便计算曲线的起始斜率，并对其曲率进行估算；　ｃ）在其中出现凝血酶生成的血浆中加入信号底物，所述信号底物在与凝血酶反应后产生与所形成的转化产物相关的可检测信号；　ｄ）向同样的样品或其中出现凝血酶生成的相同血浆 的另一个样品中加入荧光化合物，提供可检测的信号，以供用作血浆引起的浊度和／或颜色对信号的影响的度量；　ｅ）将步骤ｄ）中的测量结果与步骤ａ）中的测量结果进行比较，以建立一种相关性来校正其中出现凝血酶生成的血浆的浊度和颜色；以及　ｆ ）使用在步骤ｂ）中测定的１）的测量结果的曲率，来校正在其中测量信号的系统的非线性，并使用从步骤ｂ）得到的起始斜率，从步骤ｃ）中测量的信号来计算即时的凝血酶浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.6.6 EP 06011678.71.在凝固的血浆中测定即时的凝血酶过程的方法，其包括下列步
骤：
a)将信号底物加入到含有预定量凝血酶活性的反应混合物中，所
述信号底物在与所述凝血酶活性反应后，产生与所形成的转化产物相
关的可检测信号；
b)通过数学方法确定步骤a)中的即时信号曲线的特征，以便计
算曲线的起始斜率，并对其曲率进行估算；
c)在其中出现凝血酶生成的血浆中加入信号底物，所述信号底物
在与凝血酶反应后产生与所形成的转化产物相关的可检测信号；
d)向同样的样品或其中出现凝血酶生成的相同血浆的另一个样
品中加入荧光化合物，提供可检测的信号，以供用作血浆引起的浊度
和/或颜色对信号的影响的度量；
e)将步骤d)中的测量结果与步骤a)中的测量结果进行比较，以建
立一种相关性来校正其中出现凝血酶生成的血浆的浊度和颜色；以及
f)使用在步骤b)中测定的1)的测量结果的曲率，来校正在其中测
量信号的系统的非线性，并使用从步骤b)得到的起始斜率，从步骤c)
中测量的信号来计算即时的凝血酶浓度。
2.在第一个生物学样品中实时测定蛋白水解活性从样品中出现并
消失的过程的方法，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，所述方法
包括下面的步骤：
a)在所述第一个样品中加入蛋白酶激活剂以生成蛋白水解活性；
b)在步骤a)中加入信号底物，所述信号底物在被生成的蛋白水解
活性反应后，产生与形成的转化产物的量相关的可检测信号；
c)在适当的介质例如缓冲液中加入对步骤b)中定义...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·L·A·吉森，C·P·蒂莫西·范阿斯藤，
申请(专利权)人：凝血酶测量有限公司，
类型：发明
国别省市：NL