本发明专利技术涉及一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法：１）称取鲜土样品二组２ｎ（ｎ≥３）份置于三角瓶中，向三角瓶中加入甲苯和缓冲溶液，向第一组三角瓶中加入１ｍｌ底物对硝基苯磷酸二钠溶液，第二组作为样本对照，摇匀，盖好瓶塞后恒温培养；２）培养结束后，向第一组和第二组加碱性三羟基氨基甲烷溶液和氯化钙溶液终止反应并显色，并向第二组加入底物溶液，混匀，过滤；３）用分光光度计在４１０ｎｍ处比色测定吸光度值Ａ；４）根据标准曲线计算对硝基苯酚含量，进而计算磷酸单酯酶活性。本发明专利技术优点为：１）简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；２）减少对设备要求的依赖性；３）方法准确度高，易操作；４）结果稳定可靠，重现性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及土壤中磷酸单酯酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤 屮磷酸单酯酶活性的分析方法。技术背景土壤中的磷酸单酯酶能将在土壤磷代谢过程中形成的有机磷酯水解成 正磷酸盐，参与有机磷的脱磷过程，成为可被微生物和作物利用的有效态。在pH4 — 9的土壤中均有磷酸单酯酶，多以积累态存在。磷酸单酯酶可水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对 硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。酸性和碱性磷酸酶的活性可 以通过控制反应的pH值来分别测定。对硝基苯磷酸盐磷酸单酯酶一 对硝基苯酚因此，土壤中磷酸单酯酶活性的强弱影响到土壤磷代谢过程中磷素损 失的大小，间接影响磷肥的利用效率。土壤磷酸单酯酶对土壤磷素的有效 性具有重要作用，可以表征土壤磷酸转化方向和强度。土壤中磷酸单酯酶 的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地等的强烈影响，同时也受农田 耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中磷酸单酯酶活 性的检验具有重要的意义。目前有关磷酸单酯酶活性的测定虽然已经形成 一个相对可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤类型测定的 差异性，以及不同培养批次的差异性和不确定性，难以定性比较和定量研 究土壤中磷酸单酯酶活性，降低了实验效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种土壤中磷酸单酯酶活性的检测方法。在借鉴 其它酶测定方法原理的基础上，该方法根据磷酸单酯酶的特性，对其测定 步骤和显色方法进行改进。该方法减少了试验步骤的不稳定性，使分析结 果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现.t.述目的，本专利技术采用的技术方案为 一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法， l)分别称取1 -2&鲜土样品211份分别置入211个500^三角瓶中，论3， 分成二组，每组n个，向二组2n个三角瓶中加入0.2 -0.4 mi分析纯甲苯和 4 -8 ml pll 6.45-6.55缓冲溶液试剂，向第-一组n个三角瓶中加入1 — 2 mL 25 -50 m moL. L—'的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组n个三角瓶中作 为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在36.5 -37.5T:恒温培养箱中恒温培养1-2 h:2) 培养结束后，向所有三角瓶中加入4 -8 mL 0.09 - O.llmoL' L' pH 11.5-12.5的碱性三羟基氨基甲烷溶液和1 -2mL 0.25-0.5 moL' L"氯化钙溶 液，向样木对照组n个三角瓶中添加1 -2 mL 25 -50 m moL' L—1的底物对硝 基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤；试验中加入的碱性缓冲液溶液是用来终止酶促反应，抑制磷酸单酯到 磷酸的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的分解作用而对产物测定产生 颜色千扰，同时避免在一定时间内产生沉淀而影响测定。3) 用分光光度法于410 nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别 用分光光度法在410nm测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b;根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酷的浓度S， S=A*b;计算样品中对硝基苯酚含量m,;4) 计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为w=mi/ (m2xK) 3吗(:61"151\1〇3'^干土'11-| 式中W:单位土壤单位吋间内对硝基苯酚的产生量；ml:测试溶液中 对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2:鲜土样品质 量；k:水分系数，单位重量的烘干土重/鲜土重。当步骤3)中的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度吋溶液的颜色，表明其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若颜色还是过深(目测比对制作标准曲线最高浓度时的溶液颜色)，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410 nm处测定溶液的吸光度 A。所述制作工作标准曲线过程为称取IOOO mg对硝基苯酚溶解于l L 蒸馏水中，制备标准贮备液；吸取标准贮备液lmL，定容到100mL，此为 0.01 mg mL"对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、 1、 2、 3、 4、 5 mL 于试管中，用蒸馏水补足到相同体积5 mL，加入4 mL 0.1 moL， L—1碱性 THAM (三羟基氨基甲烷)缓冲溶液和1 mL 0.5 moL. L—1氯化钙溶液，显色、 混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A，； 此标准 系列含对硝基苯酚的的浓度分别为0、 1、 2， 3、 4和5 (ig 'mL"(量为0， 10， 20， 30、 40和50吗)，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值 A'制作工作标准曲线，得到斜率b。所述碱性THAM缓冲溶液的配制过程为称取12.2 g三羟甲基氨基甲 烷(THAM)于800 mL蒸馏水中，用0.5 mol L"的NaOH调节pH至12.0， 用蒸馏水定容到1000 mL。本专利技术方法改进的依据土壤中的磷酸单酯酶是参与土壤中e—甘油磷酸酯、苯磷酸酯、P—萘磷酸酯、硝基苯磷酸酯等的水解的一类酶的总称，在测定过程中分解底物 对硝基苯磷酸二钠生成对硝基苯酚，需要加入氢氧化钠和氯化钙终止反应 并显色。 一定浓度的氢氧化钠加入土壤溶液中会造成土壤有机质分解，生 成产物呈褐色，在一定程度上影响比色结果。本试验中添加碱性三羟基氨 基甲垸溶液即可避免土壤有机质分解，减少颜色干扰，同吋避免在测定过 程中产生大量碳酸钙沉淀而影响测定的稳定和准确。 本专利技术所使用的测定原理为土壤中的磷酸单酯酶能够水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后 释放的对硝基苯酚的含量，来估计磷酸单酯酶的活性。本试验拟通过反应 后对硝基苯酚C6H5N〇3的生成量来表征土壤磷酸单酯酶活性。酸性和碱性 磷酸酶的活性通过控制反应的pH值来分别测定。测定酸性磷酸酶活性时，溶液的pH值为6.5。与其它酶的分析方法相比较，本专利技术的优点主要有1) 所需设备简单、降低了试验成本。本专利技术中的培养试验是在50 mL 的三角瓶中进行，培养结朿后直接过滤到15ml试管中。2) 所使用的方法显色简单，提高了样品测定的准确度。3) 操作简单，减少操作过程的复杂性；分析结果稳定可靠，重现性好。 该酶的其它测定方法中需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要不加底 物的样品对照。同时，由于本专利技术所涉及到的显色步骤减少了土壤有机质 碱解形成的颜色以及显色步骤产生的碳酸钙沉淀对测定结果的影响而导致 不确定性，故分析结果重现性非常良好。具体实施方式 试剂配制1) 对硝基苯磷酸二钠溶液(0.05mol.L—称取0.9303 g六水对硝基 苯磷酸二钠溶于40 mL pH 6.5的缓冲溶液，然后用同一种缓冲溶液稀释至 50mL，低温贮存备用。2) 缓冲溶液(pH6.5):称取12.1g三(羟甲基)氨基甲烷、11.6 g丁 烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3 g硼酸于488 mL氢氧化钠溶液[C (NaOH)= lmol丄力中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用；取出200mL上述溶液 至1000mL烧杯中，用盐酸(O.lmol'L")溶液调至pH6.5。3) 甲苯，分析纯。4) 0.5 mol ' L一1 CaCl2溶液称取73.5 gCaCl2.2H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测土壤中酸性磷酸单酯酶活性的分析方法，其特征在于： １）分别称取１－２ｇ鲜土样品２ｎ份分别置入２ｎ个三角瓶中，ｎ≥３，分成二组，每组ｎ个，向二组２ｎ个三角瓶中加入０．２－０．４ｍｌ分析纯甲苯和４－８ｍｌ ｐＨ６．４５－６．５５缓冲溶 液试剂，向第一组ｎ个三角瓶中加入１－２ｍＬ ２５－５０ｍ ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，以第二组ｎ个三角瓶中作为样本对照，混匀，盖好瓶塞，放在３６．５－３７．５℃恒温培养中恒温培养１－２ｈ； ２）培养结束后，向所有三角 瓶中加入４－８ｍＬ ０．９５－０．１５ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］ｐＨ＝１１．５－１２．５的碱性三羟基氨基甲烷溶液和１－２ｍＬ ０．２５－０．５ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］氯化钙溶液，向样本对照组ｎ个三角瓶中添加１－２ｍＬ ２５－５０ｍ ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］的底物对硝基苯磷酸二钠工作液，混匀，过滤； ３）用分光光度法于４１０ｎｍ处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度Ａ； 以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在４１０ｎｍ测定的吸光值Ａ’制作工作标准曲 线，得到斜率ｂ； 根据吸光值Ａ和斜率ｂ，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度Ｓ，Ｓ＝Ａ＊ｂ；计算样品中对硝基苯酚含量ｍ↓［１］； ４）计算磷酸单酯酶酶活性： 计算公式为：ｗ＝ｍ↓［１］／（ｍ↓［２］×Ｋ）＝Ｓμｇ Ｃ↓［６］Ｈ↓［ ５］ＮＯ↓［３］.ｇ↑［－１］干土.ｈ↑［－１］ 式中：ｗ：单位土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；ｍ↓［１］：测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；ｍ↓［２］：鲜土样品质量；ｋ：水分系数，单位重量的烘干土重／鲜土 重。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉兰，武志杰，陈利军，陈振华，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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