一种酸性磷酸酶活性的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种测定酸性磷酸酶活性的方法，所述方法以L-抗坏血酸-2-磷酸作为酸性磷酸酶的催化底物，该底物在酸性磷酸酶的催化下水解为L-抗坏血酸，由于L-抗坏血酸可以将二价铜还原成一价铜，使得作为显色探针的二价铜复合物转化为深色的一价铜复合物，样品中酸性磷酸酶活性越高，检测液颜色变化越明显，从而实现对酸性磷酸酶活性的半定量比色分析或用紫外-可见分光光度计进行定量检测。通过本发明专利技术的方法，能检测到0.48 mU·mL-1的酸性磷酸酶，该方法灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于血清样品中酸性磷酸酶活性的定量测定，为临床样品中酸性磷酸酶活性的检测提供了一种快速、简便、低廉、灵敏且性能稳定的比色分析方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分析
，具体涉及，尤其涉及一种基于比色分析快速测定酸性磷酸酶活性的方法。
技术介绍
酸性磷酸酶(acid phosphatase，EC3.1.3.2，ACP)主要存在于巨.细胞，定位于溶酶体内，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖等。正常人血清中的ACP主要来源于前列腺、骨、肝、肾、脾、胰等组织，不论男女老幼，其含量大致相同。而前列腺疾病患者以及出现变形性骨髓炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、多发性骨髓瘤、原发性骨肿瘤、甲状腺功能亢进、白血病、乳腺癌、心肌梗死、肝炎、肝硬化、胆囊炎、溶血性疾病和急性尿潴留等疾病时，血清中ACP的水平都会明显升高。例如，临床研究表明，在前列腺癌患者体内，ACP水平明显升高，其升高程度与前列腺癌的病情基本呈平行关系:当病情好转时，ACP水平逐步降低;再次升高时，常提示癌症有复发、转移及预后不良。由此可见，如何简单、有效、快速地测定ACP的活性，尤其是成分复杂的临床组织和血清样品中ACP的活性，对前列腺癌的辅助诊断，尤其对晚期前列腺癌的诊断、疗效观察及预后监测具有重要的临床价值和广泛的应用前景。目前，测定ACP活性的方法主要包括以下几种:(I)对硝基苯磷酸二钠法:在酸性条件下，对硝基苯磷酸二钠在ACP的催化作用下生成黄色的水溶性产物对硝基苯酚，该产物在405nm处有光吸收，通过测定其吸光度值，并与标准曲线进行比较，即可对ACP活性进行定量分析；(2)Gomori硝酸铅法:在酸性条件下，以β-甘油磷酸钠为底物，由ACP催化水解释放出磷酸，磷酸与硝酸铅结合形成无色的磷酸铅沉淀，经硫化胺处理形成棕黑色的硫化铅沉淀；磷酸苯二钠法:在酸性条件下，ACP水解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ACP活性成正比。由此可见，在临床检测中，测定ACP活性的方法主要是基于溶液颜色的深浅变化(即溶液对光的选择性吸收)来对物质含量进行定量测定的比色分析法，这是由于比色分析法具有设备简单、分析速度快、准确度高、重现性好和适合大批量样品等优良特性。然而，上述几种方法都具有灵敏度低，抗干扰能力差，检测过程繁琐等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，特别是一种基于比色分析测定酸性磷酸酶活性的方法。本专利技术的方法灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短，成本低廉，可用于血清样品中酸性磷酸酶活性的定量测定，为临床样品中酸性磷酸酶活性的检测提供了一种快速、简便、低廉、灵敏且性能稳定的比色分析方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术解决方案:—种酸性磷酸酶活性的测定方法，包括以下步骤:将含有L-抗坏血酸-2-磷酸、二价铜离子、水溶性菲绕啉衍生物的缓冲液与待测酸性磷酸酶溶液孵育后，根据检测液的颜色变化对样品中酸性磷酸酶活性进行半定量比色检测或用紫外-可见分光光度计进行定量检测。所述缓冲液为50mMpH5.7的甘氨酸-盐酸缓冲液。所述检测液中，L-抗坏血酸-2-磷酸的浓度为50nM?lOOmM，优选为10mM。所述检测液中，二价铜离子的浓度为5nM?1mM，优选为0.2mM。所述水溶性菲绕啉衍生物包括红菲绕啉二磺酸盐、浴酮灵二磺酸盐等。所述检测液中，水溶性菲绕啉衍生物的浓度为0.01?20mM，优选为0.4mM。所述孵育温度为20?37°C，优选为25°C。所述孵育时间为0.5?150min，优选为15min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:①本专利技术的方法对酸性磷酸酶活性的检出限为0.48mU.mL—1，具有灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，重复性好，操作简单，检测时间短和成本低廉等优点；②本专利技术所需仪器设备普及化程度高，所需试剂均为商业化产品，对操作人员无特殊技术要求，并可实现半定量比色分析；③本专利技术的方法可用于临床样品中酸性磷酸酶活性的快速、高灵敏检测，而且可以大大降低检测费用和检测成本。【附图说明】图1是本专利技术酸性磷酸酶活性的测定方法的原理图。图2是本专利技术方法比色分析酸性磷酸酶活性的可行性分析及照片。其中，A为所有试剂都加，B为不加酸性磷酸酶，C为不加L-抗坏血酸-2-磷酸，D为不加浴酮灵二磺酸盐-二价铜离子。图3是本专利技术中紫外-可见吸收光谱随酸性磷酸酶活性的变化曲线及照片(A)和标准工作曲线(B)。图4是本专利技术方法比色分析酸性磷酸酶活性的选择性分析及照片。其中，A为酸性磷酸酶，B为牛血清白蛋白，C为血红蛋白，D为辣根过氧化物酶，E为链酶抗生素蛋白，F为凝血酶，G为胰蛋白酶，H为对照。图5是本专利技术方法比色分析酸性磷酸酶活性在血清样品中的分析特性及照片。其中，A为在甘氨酸-盐酸缓冲液中，B为在10 %正常人血清样品中，C为在5%正常人血清样品中。【具体实施方式】下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，以便于更好地理解本专利技术，因而不应视为限定本专利技术的范围。图1示出了本专利技术的原理，该检测原理具体如下(以浴酮灵二磺酸盐为例):酸性磷酸酶催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸生成L-抗坏血酸，L-抗坏血酸将二价铜离子还原成一价铜离子，使得二价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物转化为一价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物，从而导致溶液颜色和吸光度的变化。由于二价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物溶液为淡黄色，一价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物溶液为棕黄色，通过观察溶液颜色变化，即可对样品中酸性磷酸酶活性进行半定量比色分析。此外，由于一价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物在484nm处产生一个新的吸收峰，其强度与一价铜-浴酮灵二磺酸盐复合物的浓度成正比，因此可通过紫外-可见分光光度计对样品中酸性磷酸酶活性进行定量检测。本专利技术的方法对酸性磷酸酶活性的检测范围是O?10mU.mL—、检出限为0.48mU.mL—1。本专利技术的方法灵当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸性磷酸酶活性的测定方法，其特征在于，将含有L‑抗坏血酸‑2‑磷酸、二价铜离子、水溶性菲绕啉衍生物的缓冲液与待测酸性磷酸酶溶液孵育后，对样品中的酸性磷酸酶活性进行半定量比色检测或采用紫外‑可见分光光度计进行定量检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔金明，胡琼，梅亚琦，何玟辉，张学记，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32