2-n-庚基-4-羟基喹啉的制备方法技术

本专利公开了生物医药及农药领域中活性有机分子2‑n‑庚基‑4‑羟基喹啉(2‑n‑heptyl‑4‑hydroxyquinoline)的基因工程制备方法，包括以下步骤：利用基因工程技术对链霉菌Streptomycessp.FJS31‑2菌株的zunyimycins生物合成基因簇进行克隆与鉴定；将该基因簇整合进原核表达质粒载体pET32a，构建该基因簇的异源表达质粒载体pET‑abx；将表达质粒载体pET‑abx转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)Rosetta，IPTG诱导合成，发酵产物进行产物纯化和结构解析，得到2‑n‑庚基‑4‑羟基喹啉化合物。本发明专利技术将链霉菌的抗生素生物合成基因簇创造性通过的大肠杆菌异源表达，制备出2‑n‑庚基‑4‑羟基喹啉，为通过微生物异源表达异源抗生素生物合成基因簇的手段合成喹啉类衍生物提供基因工程菌和新的发展方向。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药及农药领域，具体涉及一种2-n-庚基-4-羟基喹啉的制备方法。
技术介绍
喹啉类衍生物是一类重要的杂环化合物，被广泛应用于香料、染料和医药工业等领域，且喹啉类化合物具有广泛的生物活性，加之其具有低毒、高效、对环境友好、结构变化多样等特点，已成为当今新农药研究的杂环结构之一，因此对喹啉类衍生物的制备也有多种方法，主要为化学合成和非基因工程手段的生物合成。生物合成中，2-n-庚基-4-羟基喹啉主要是通过从非链霉菌来源的微生物如Pseudomonasmethanica分离菌株通过发酵产生，尚无通过基因或基因簇异源表达方式在大肠杆菌宿主菌体内产生该化合物的方法，大肠杆菌自身并不产生2-n-庚基-4-羟基喹啉(2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline)。因此利用微生物异源表达生产出2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline为今后喹啉类衍生物类生物医药及农药领域发展提供基因工程菌和新的发展方向。
技术实现思路
本专利技术意在利用微生物异源表达出喹啉类衍生物，提供一种2-n-庚基-4-羟基喹啉新的的制备方法。本方案中的2-n-庚基-4-羟基喹啉的制备方法，首先，用基因工程技术对链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株的zunyimycins生物合成基因簇进行克隆与鉴定；然后，将该基因簇整合进原核表达质粒载体pET32a中，构建该基因簇的异源表达质粒载体pET-abx；再次，将表达质粒载体pET-abx转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)Rosetta，最后，通过IPTG诱导合成目的蛋白的菌株，发酵后得到发酵产物，对发酵产物进行产物纯化和结构解析，得到2-n-庚基-4-羟基喹啉化合物。其中，基因异源表达技术是指用生物信息学的方法对基因组序列进行分析，寻找其中某些酶的基因簇的保守序列，预测基因的功能、生物合成途径和基因簇的产物结构，，通过基因敲除等手段验证基因簇功能后，将基因簇DNA序列整合进相应表达质粒载体，转化宿主菌，是的宿主菌生产目的产物。异源表达即为非本体生产菌中分析基因的表达情况，通过基因工程操作，将原始菌株中的次级代谢产物的基因簇分离出来，经修饰改造后，将整个基因簇导入表达宿主中，发酵分离鉴定化合物，分析得到的新化合物。其中，对链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株发酵并分离得到卤化型聚酮化合物zunyimycins，因此zunyimycins生物合成基因簇即为链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株能表达发酵出卤化型聚酮化合物的基因。本专利技术的有益效果为：将链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株来源的的zunyimycin生物合成基因簇在大肠杆菌体内异源表达，首次制备出2-n-庚基-4-羟基喹啉，为通过基因工程手段微生物生产喹啉类衍生物提供新的发展方向。进一步优化的，：链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株的保藏号为：CGMCC4.7321，在中国普通菌种保藏中心保存。进一步优化的，所述zunyimycins生物合成基因簇的NCBI提交序列号为No.KU243130。进一步优化的，所述IPTG诱导合成的温度为18～28℃，表达的最适温度为18℃。附图说明图1为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉质谱分析图；图2为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉氢谱分析图；图3为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉碳谱分析图；图4为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉HMBC谱图分析图；图5为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉HSQC谱图分析图；图6为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉ROESY谱图分析图；图7为本专利技术2-n-庚基-4-羟基喹啉COSY谱图分析图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：链霉菌Streptomycessp.FJS31-2材料信息1.生物学命名：链霉菌Streptomycessp.FJS31-2(基因组序列号：PRJNA320463)2.基本生物学特性：气生菌丝发达，米黄色菌落，边缘粗糙，有皱褶；孢子数目偏少；mol％G+C＝73％。3.分离培养基：固体GYM(ISP2)：葡萄糖4g，麦芽抽提物4g，酵母粉10g，碳酸钙2g，琼脂粉18g，加水至1000毫升，灭菌。4.建议培养条件：固体GYM培养基：最适培养温度28℃，建议培养时间：4天。5.分离地点：贵州省梵净山自然保护区(海拔高度800m，东经108°47′50″，北纬27°56′32″)。6.保藏地点：中科院微生物所中国普通菌种保存中心(菌保号：CGMCC4.7321)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号：中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101。7.保藏时间：保藏时间为2016年6月2日。8.分类依据：经16SrRNA保守引物(27f/1492r)扩增，测序并在线比对分析和参考菌株StreptomycessparsogenesstrainNBRC13086的同源性为99％，初步分类为链霉菌。链霉菌Streptomycessp.FJS3-216sRNA序列：TGCAGTCGAACGATGAAGCCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCTTACTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGtGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAaGgAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTC本文档来自技高网...

【技术保护点】
2‑n‑庚基‑4‑羟基喹啉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，用基因工程技术对链霉菌Streptomyces sp.FJS31‑2菌株的zunyimycins生物合成基因簇进行克隆与鉴定；然后，将该基因簇整合进原核表达质粒载体pET32a中，构建该基因簇的异源表达质粒载体pET‑abx；再次，将表达质粒载体pET‑abx转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)Rosetta，最后，通过IPTG诱导合成目的蛋白的菌株，发酵后得到发酵产物，对发酵产物进行产物纯化和结构解析，得到2‑n‑庚基‑4‑羟基喹啉化合物。

【技术特征摘要】
1.2-n-庚基-4-羟基喹啉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，用基因工程技术对链霉菌Streptomycessp.FJS31-2菌株的zunyimycins生物合成基因簇进行克隆与鉴定；然后，将该基因簇整合进原核表达质粒载体pET32a中，构建该基因簇的异源表达质粒载体pET-abx；再次，将表达质粒载体pET-abx转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)Rosetta，最后，通过IPTG诱导合成目的蛋白的菌株，发酵后得到发酵产物，对发酵产物进行产物纯化和结构解...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳昌武，王苗，吕玉红，钱声艳，保玉心，王荫荫，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52