本发明专利技术涉及基因重组技术，具体地说是白介素－２（ＩＬ－２）和肠毒素Ａ（ＳＥＡ）的融合基因及其制备，它具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中碱基序列，以天然的ＳＥＡ基因和突变的ＩＬ－２基因为基础，利用ＰＣＲ技术，设计适当的连接物，将两个基因连接起来制得融合基因；该基因能在大肠杆菌中表达。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组技术，具体说是一种白介素-2(IL-2)和肠毒素A(SEA)融合基因及其制备。
技术介绍
IL-2是一种激活T-细胞产生在淋巴细胞间作用淋巴因子；人类IL-2是一条由133个氨基酸残基组成的多肽链(Rene Devos，Geert Plaetinck，HildeCheroutre，Guus Simons，Wim Degrave，Jan Tavernier，Erik Remaut and WaltrFiers，Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression inE.coli.，Nucleic Acids Research，1983，11(13)4307-4323)；最近几年IL-2用于肿瘤治疗的研究使人们重视了它的人工置备。SEA是一种单亚基蛋白质，其前体由257个氨基酸组成，包括N端24个残基构成的信号肽；前体经信号肽酶加工后转变为成熟SEA，其分子量为27KD(Marsha JB，John J.Mekalanos.Nucleotide Sequence of the type AStaphylococcal enterotoxin Gene.J.Bacteriol.1988；170(1)34-41)。最近几年用于抗肿瘤的导向药物研究；有IL-2和绿脓杆菌毒素制得融合基因的报道(Lorberboum-Galski H，Garsia RJ，Gately M，Brown P S，Clark R E，WaldmannTA，Chaudhary V K，FitzGerald D J，Pastan I.IL2-PE664Glu，a new chimericprotein cytotoxic to human-activated T lymphocytes.J Biol Chem.1990；265(27)16311-16317.)。有关白介素-2和肠毒素A融合基因的研究还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的的目的是提供一种新的、其表达可用于抗肿瘤靶向药物的白介素-2和肠毒素A融合基因及其制备。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下白介素-2和肠毒素A融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。白介素-2和肠毒素A融合基因的制备方法，以天然SEA基因和突变的IL-2基因为基础，通过连接物(linker)5′ggtggtggtggtggtggtacc3′制得融合基因；IL-2基因在融合基因的5′端，SEA基因在融合基因的后边，即IL-2的C端通过肽连接物与SEA的N端相连接。以天然的SEA基因为模板，采用引物SEA-F 5′ACGGTACCAGCGAGAAAAGCGAAG 3′和SEA-R 5′CGGAAGCTTCTATTAACTGGTATATAAATAGATAGCAAT 3′通过PCR技术扩增出SEA基因片段；以突变的IL-2基因为模板，采用引物IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′和IL-2-R 5′ACGGGTACCACCACCACCACCACCAGTCAGAGTAGAGATG 3′通过PCR技术扩增出IL-2基因片段。突变后的IL-2基因碱基序列(详见，中国专利申请号03111487.3)如下1 GCTCCGACTT CTAGCTCTAC CAAGAAAACC30 CAGCTGCAGC TGGAACACCT GCTGCTGGAT60 TTACAGATGA TTCTGAACGG TATCAACAAC90 TACAAGAACC CGAAACTGAC CCGTATGCTG120 ACCTTCAAGT TTTACATGCC GAAGAAAGCT150 ACCGAACTGA AACATCTTCA GTGTCTAGAA180 GAAGAACTCA AACCTCTGGA GGAAGTTCTG210 AACCTGGCTC AGAGCAAAAA CTTTCACCTG240 CGTCCGCGTG ACTTAATCAG CAATATCAAC270 GTAATAGTTC TGGAACTGAA AGGTTCTGAA300 ACCACCTTCA TGTGCGAATA TGCTGATGAG330 ACAGCAACCA TTGTAGAATT TCTGAACCGT360 TGGATTACCT TCTCTCAGTC TATCATCTCT390 ACTCTGACT-3′为表达和药用需要天然IL-2和SEA基因进行了适当突变，SEA的第227位的天冬氨酸突变成了丙氨酸，IL-2的125位半胱氨酸突变为丙氨酸。Linker为5′ggtggtggtggtggtggtacc3′相对应的肽为6个甘氨酸和1个苏氨酸即-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-本专利技术具有如下优点1.本专利技术为人工制备的一新基因，属首次制得的基因，该基因的表达可用于抗肿瘤靶向药物的研究和药物。2.应用本专利技术，可进一步提供直接用于生产IL-2(125Ala)-SEA(227Ala)的工程菌株。3.本专利技术基因的表达提供了一种新的蛋白，较好地利用了IL-2的导向功能，可充分发挥SEA的抗肿瘤作用。附图说明图1为融合基因在大肠杆菌中表达电泳图；其中1为中型蛋白标准，2为对照，3为本专利技术实例工程菌。具体实施例方式实施例1白介素-2和肠毒素A融合基因，具有SEQ ID NO1所示的序列(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1122碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源白介素-2(human interleukin 2)，肠毒素A(Staphylococcal enterotoxin A)材料菌株和E.coli DH5α、JM109(DE3)为市购获得；质粒含有该融合基因的质粒，pTE-30a-(+)表达载体，7ZTS载体(参见中国专利申请02109681.3)本实例构建(也可用市购7Z替代)；分子生物学试剂Taq DNA polymerase，Pfu DNA polymerase，dNTP，hind III，Nde I，T4 DNA Ligase皆为美国Promega公司产品，胶回收及质粒提取试剂盒都是上海华舜公司产品，琼脂糖购自FMC生物制品公司，其余产品均为国产分析纯；仪器Sprint PCR仪是英国Hybaid公司产品，离心机micromax230由IEC(International Equipment Company)公司制造，基因脉冲转化仪是Bio-Rad产品，DFD电泳仪是北京东方特力科贸中心产品，ShimadzuDual-Wavelength TLC Sanner，CS-930。制备过程1.融合基因突变和扩增采用PCR方法；参考文献时成波，吕安国，吴文芳，杨立泉等，改变稀有密码子提高SEA的表达水平，《生物工程学报》2002，18(4)477-480. 2.融合基因的鉴定1)质粒的提取参照文献《精编分子生物学实验指南》和J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白介素－２和肠毒素Ａ融合基因，其特征在于：具有序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：１中碱基序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文芳，杨立泉，吕安国，时成波，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，屹昌科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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