重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素(STp)融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用，本发明专利技术中所述的融合蛋白STp5-His的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术中猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素STp成熟肽基因(estp)经过4次串联后表达出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp蛋白具有了良好的免疫原性。本发明专利技术采用细胞融合技术制备出针对该融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体，解决了生产实践中无法对STp进行检测的难题，且该特异性单克隆抗体能够在体外中和天然STp，具有临床应用的前景。

【技术实现步骤摘要】
重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白及其应用，具体涉及猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素STp基因(estp)经过4次串联后表达出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp具有了良好的免疫原性，本专利技术属于基因工程及免疫学

技术介绍
产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是引起幼畜、儿童和旅行者腹泻的主要病原菌，是造成新生仔猪、犊牛腹泻的重要病原之一。在家畜中，尤其以初生幼畜特别易感，可造成生长发育迟缓、生产能力低下、严重的可以导致死亡，给畜牧业带来严重经济损失。ETEC毒力因子包括黏附素、肠毒素、水肿病毒素、内毒素、溶血素以及EatA等。其中，肠毒素在ETEC的致病机理中发挥重要作用。肠毒素包括：耐热肠毒素(heat-stableenterotoxin,ST)和不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin,LT)，其中ST是造成严重腹泻的主要毒力因子之一。根据ST的生物学特性可将其分为：STI(或STa)和STⅡ(或STb)两类。STa能引起新生仔猪(1～3日龄)和乳鼠肠积水，可导致儿童发生腹泻；STb只能引起断乳小猪和兔的肠积水，对乳鼠没有致病性。STa在ST引起的腹泻病中占主要地位。根据来源不同，STa分为猪/牛源(STp)和人源(STh)。STp与STh结构相似，有14个氨基酸残基及3个二硫键相同，成熟的STp有18个氨基酸，成熟的STh有19个氨基酸，二者在抗原性上没有差别，能通过基因探针加以识别。由于STa分子量小(约2Ku)，很难获得天然纯品，且此蛋白不具有免疫原性。STa无法被蛋白质染色剂染色，也不能直接包被到ELISA板上，因此无法采用SDS-PAGE法和ELISA方法对其进行直接检测，给临床ETEC的检测带来很大困难。由ETEC引起的腹泻疾病中，ST发挥重要作用，据Rebertson的调查研究表明：20％～30％的ETEC为LT+/ST-；30％～40％的ETEC为LT+/ST+；接近50％的ETEC为LT-/ST+。也就是说在大部分的ETEC引起的严重腹泻中，均有ST的存在，所以对ST进行快速、准确的检测有利于对腹泻病的早期诊断，采取有效治疗方案，降低经济损失。据统计，STp是造成新生仔猪和犊牛腹泻，甚至死亡的重要毒力因子之一。目前对STa的检测方法是乳鼠灌胃法。将新生BALB/c乳鼠(1～3日龄)随机分组，将细菌过夜培养物上清中加入2％的伊文斯蓝10μl/ml。每只乳鼠灌饲0.1ml，25℃静止4h后，腹部解剖后取全部肠管，计算灌胃后乳鼠的G/C(肠重/剩余尸重)值进行结果判定，当G/C值≥0.09时，判为STa阳性，G/C值≤0.083时，判为STa阴性，两者之间判为可疑。该方法与血清学方法相比敏感性较低，需要特定的实验动物，操作繁琐，不利于实验室对STa的快速检测。因此，制备针对STa的特异性抗体，建立快速、敏感、特异的血清学检测方法对深入开展ETEC相关研究具有重要的理论和实际意义。由于STa蛋白较小，免疫原性差，单独免疫后无法刺激动物体产生相应抗体。虽然通过化学方法提纯可以获得品质较高的STa蛋白，但纯化工艺复杂，样品损失量大，因此获得具有免疫原性的STa蛋白是制备特异性抗体的前提。目前主要有两种方法获得具有免疫原性的STa蛋白：(1)基因融合方法：一般选择将STa基因与其它比较大的载体蛋白基因进行融合，表达融合蛋白，通过这种方法获得具有免疫原性的STa融合蛋白。例如将STa基因与LTB亚单位基因连接、STa基因与K99基因融合或STa基因与β-半乳糖苷酶基因融合在一起等，其中将STa基因与LTB基因融合进行提高STa免疫原性的研究较多。徐兵等(1999)将ETEC的LTB亚单位基因和ST基因融合并进行了表达，用表达的融合蛋白免疫小鼠后，抗ST的血清抗体效价为免疫前的100倍，抗LTB的血清抗体效价为免疫前的1000倍，由于LTB是强免疫原，所以抗ST的血清抗体效价明显低于抗LTB血清抗体效价。李敏等(2009)通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STa毒素中心的6个Cys分别突变为Ser和Gly，将突变后的STa与K99菌毛基因连接，表达的融合蛋白能够被抗ETECC83922的多克隆抗体特异性识别，但是没有明确说明STa抗体的产生。李书光等(2009)利用基因工程技术构建了k99-estA融合基因及其原核表达载体，并对表达的融合蛋白进行了初步免疫原性分析。结果显示，用该蛋白免疫动物能够获得抗STa蛋白的特异性抗体，乳鼠灌胃实验证明该抗体能中和天然STa，对乳鼠有保护作用。(2)化学偶联方法：此方法首先需要纯化ST，使其达到同质的标准。然后将其与其它大分子蛋白质(如BSA、GST、HAS)通过化学剂进行偶联。例如Aref(2012)利用二甲基甲酰胺(DMF)作为结合剂将纯化后的STa与经过修饰的牛血清白蛋白(MBSA)连接，合成了STa-MBSA共轭物蛋白，用此蛋白免疫新西兰大白兔，获得的抗STa血清抗体效价可达到1:1×106。但以上获得免疫原性STa蛋白的方法均具有不足之处。采用常规的基因融合方法将STa基因与LTB基因或其它的基因进行融合，表达的融合蛋白能够在不同程度上诱导免疫动物产生针对STa的抗体，但STa基因大小没有变化，只是将其与某个大分子量蛋白基因连接在一起进行融合表达，融合蛋白中STa蛋白的比例仍然较小，导致该融合蛋白免疫动物后产生针对STa的特异性抗体的效价往往不高。而通过化学方法将STa与其它半抗原蛋白偶联以获得免疫原性STa蛋白的方法，首先需要提纯STa。STa因为蛋白质分子量小难以进行提纯且纯化工艺复杂，另外，化学偶联试剂价格昂贵、无法批量生产，而且这些化学偶联剂如碳化二亚胺、戊二醛等会造成偶联蛋白之间的随机偶联，甚至会造成STa三级构象的改变，使其抗原表位发生变化，从而影响最终蛋白的免疫效果。为解决上述难题，获得具有免疫原性的STp蛋白，本专利技术将estp进行4次串联，构建了estp5-his基因片段，使estp从54bp增加至447bp。将该基因片段插入pGEX-6P-1载体，构建pGEX-6P-estp5-his表达载体。将获得的表达载体转入BL21(PlySs)感受态中，表达了融合蛋白STp5-His，大小约为38Ku，理论上使融合蛋白STp5-His的分子量比天然STp增加了5倍，增强了其免疫原性。而且用其免疫动物，能够刺激小鼠产生抗STp特异性抗体。因此，用此融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c鼠，采用细胞融合技术制备了针对融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体，为建立STp血清学检测技术提供了有效的检测试剂，解决了用血清学方法检测STp的难题，且该特异性单克隆抗体能够体外中和天然STp，具有临床治疗的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服天然STp不具有免疫原性，无法用其免疫动物制备特异性抗体来建立血清学检测方法的难题，提供一种新型重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白以及由该重组蛋白免疫动物制备得到的特异性抗体。本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5‑His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。2.编码权利要求1所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种含有如权利要求2或3所述核苷酸序列的重组表达载体。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，通过以下方法构建得到：(1)基因的设计：参照耐热肠毒素STp成熟肽基因序列，进行大肠杆菌密码子优化后，设计并合成如下两段核苷酸序列：estp-linker以及estp-his；其中，estp-linker的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，estp-his的核苷酸序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：师东方，韩林林，包军，董秀梅，朱妍，张萍，刘文鑫，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23