大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm的体外制备方法技术

本发明专利技术公开一种大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm全毒素的体外制备方法，依次将LTm全基因eltm、LTA、LTB两亚基的基因eltA(+)和eltB(+)以及除去两亚基基因序列中的信号肽序列的eltA(-)和eltB(-)分别载入五个载体中，通过各个重组质粒工程菌的表达量的对比，筛选出高表达量的工程菌，再通过亚基的体外装配以及装配条件的优化进而高效制备LTm。本发明专利技术主要运用LTA和LTB各亚基分别优化表达和高效高量制备的基础上在体外进行人工组装成整体蛋白，以克服多亚基复杂蛋白对其整体进行基因表达效能降低的问题，从而促进疫苗黏膜免疫佐剂的高效制备。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm全毒素的体外制备方法，依次将LTm全基因eltm、LTA、LTB两亚基的基因eltA(+)和eltB(+)以及除去两亚基基因序列中的信号肽序列的eltA(-)和eltB(-)分别载入五个载体中，通过各个重组质粒工程菌的表达量的对比，筛选出高表达量的工程菌，再通过亚基的体外装配以及装配条件的优化进而高效制备LTm。本专利技术主要运用LTA和LTB各亚基分别优化表达和高效高量制备的基础上在体外进行人工组装成整体蛋白，以克服多亚基复杂蛋白对其整体进行基因表达效能降低的问题，从而促进疫苗黏膜免疫佐剂的高效制备。【专利说明】
本专利技术涉及生物
，更具体地讲，涉及一种大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm 的体外制备方法。
技术介绍
各种传染病的不断发生，对现有的疫苗提出了新的挑战。比传统注射疫苗更加的 方便、快捷的粘膜免疫疫苗，已成为目前国内研究的新方向。而安全有效的粘膜免疫佐剂正 成为粘膜免疫疫苗制备的关键。 皮肤、粘膜是机体抵抗外界感染的第一道防线，皮肤主要通过物理隔绝的方式来 行使其保护功能，而粘膜除了物理隔绝作用外，还通过与之相关的淋巴组织，对外来物病原 体生相应的应答，行使免疫作用。临床上，大约有70 %以上的细菌、病毒和寄生虫都是通过 粘膜入侵机体，引发疾病。 传统的免疫方式（如肌肉、皮下及皮内注射）能够诱发全身的免疫应答，却不能产 生有效的粘膜的局部免疫应答，不能有效控制粘膜感染。为加强局部粘膜免疫，激活粘膜免 疫应答，使疫苗发挥最大作用，通过粘膜进行接种就显得十分重要。与传统的注射疫苗相 t匕，粘膜疫苗的接种途径与应用方法更为简便、快捷。粘膜疫苗可通过口服和气雾、点睛、滴 鼻等方式导入机体，易于让病人接受，避免了注射引起的强烈刺激和伤口感染；不需专业医 护人员的操作，便于大规模接种。更重要的是粘膜疫苗可以通过诱导粘膜和全身的免疫应 答来提高疫苗的免疫效果。粘膜免疫可以诱导局部粘膜产生分泌性IgA(SlgA)、IgM和IgG 等保护性抗体，并且可以诱导其它部位的粘膜也产生slgA，这是粘膜免疫保护作用的主要 机制。此外，粘膜免疫还诱导粘膜CTL反应，产生分泌IFN- γ的⑶4+T细胞，这对于病原体 侵入的预防和清除是非常重要的。 现有的研究表明，绝大多数非复合抗原，如：纯蛋白质抗原经粘膜递送时免疫原性 较弱，持续时间短，尤其是口服途径，只有大量和反复接种后才可能引起免疫应答，难以取 得理想的免疫保护效果，有时还会引起免疫耐受。寻找能够增强疫苗粘膜免疫原性的粘膜 佐剂就成为粘膜疫苗开发中的关键问题。粘膜疫苗通过粘膜佐剂的辅佐与增强作用，才能 获得持久的粘膜免疫应答，粘膜佐剂的辅佐是抗原激起粘膜免疫应答的一个重要条件。 大肠杆菌热敏肠毒素（Heat-labile Enterotoxin, LT)是肠毒性大肠杆菌 (Enterotoxic Escherichia coli, ETEC)产生的一种毒素，能够引起人和其它哺乳动物的 水样腹泻。除了毒性之外，LT全毒素以及分别的LTA、LTB亚基能有效启动局部免疫及全身 的体液免疫和细胞免疫，可以显著增强宿主特异性免疫应答，是一种潜在的粘膜免疫佐剂。 研究发现，通过定点突变技术，改变某些位点氨基酸可达到降低LT毒性的目的，使其真正 能够应用于临床实践中。通过突变技术获得的一系列减毒、低毒突变体LTm，不仅降低了 LT 的毒性、而且还保留了其强有力的佐剂功能，在细胞实验、动物实验以及临床实验中都取得 了良好的效果。因此，采用基因工程技术高效制备减毒且可作为粘膜免疫佐剂的LT突变体 LTm及其亚基已成为国内外研究普遍追求的目标。 编码LT的基因全长1149bp，位于野生型产毒性大肠杆菌的质粒上。该基因包括 LTA信号肽（18个氨基酸）的基因54bp、编码LTA (240个氨基酸）的基因720bp、编码LTB 信号肽（21个氨基酸）的基因63bp及编码LTB (103个氨基酸）的基因309bp。在编码LTA 的基因末尾与编码LTB信号肽基因开头处有一个4bp的重叠阅读框，二者以共转录的方式 形成mRNA。 完整的LT六聚体毒素，由一个有毒性的A亚基（约为29KD)和五个形成环装的无 毒的B亚基（约为11. 5KD)所组成，国外的有的学者将其形象的比喻成"月球车"。在LT全蛋 白中，A、B亚基比例是1 :5,但是这并非是A亚基和B亚基在大肠杆菌内真实得表达水平表 达量情况。在利用同位素示踪法掺入对A、B亚基的分泌及全毒素装配动力学的研究发现， 在细胞周质中的比例为I. 4-1. 7A/5B，其中绝大部分的B和A结合在一起，只有55% -60% 的A和B结合，而多余的A亚基则被菌体自身降解。B亚基被合成以后一分钟内就被分泌到 细胞的周质中，约80%会迅速的聚集成寡聚体。B亚基虽然离启动子比较远，但是B亚基比 A亚基表达量高很多。X射线晶体结构分析表明，B亚基有两组分别由三个反平行的β片层 结构、一个N末端的α螺旋和一个长的位于中心的α螺旋组成，N末端的α螺旋通过二 硫键与β 5片层连接。B5聚体与A亚基相邻面平行，而中心的α螺旋从另一面向外延伸， 形成一个由50-60为氨基酸组成的小环，按这种结构合成的肽段可诱导机体产生抗LT的抗 体。B 5五聚体间只有相邻的单体间有相互作用，五聚体形成后，原表面39%都会包埋起来， 有利于维持Β5五聚体结构的稳定。其中心的α螺旋有25个阳离子和15个阴离子，可以 形成一个强的亲水区，虽然B 5五聚体的离子中心里亲水性很强，但是只有几个特异性结合 的相互作用力，即空洞中心两头的两个疏水键和一个离子键。 由于LT结构的特殊性与复杂性，利用通常的基因工程技术制备实践证明有较大 的困难。在采用大肠杆菌作为表达宿主制备LT的过程中，LT在大肠杆菌中的表达量非常 的低，只有1-5%。有研究表明，在LT基因正常表达形成LT蛋白的过程中，不到50%的LTA 亚基与LTB亚基进行了结合装配成AB5形式。通过调节LTA亚基和LTB亚基的表达量上的 比例关系来达到提高LT的产量已成为热点之一。 虽然LT突变体在粘膜免疫研究以及粘膜免疫疫苗开发中具有重要的医学价值和 经济价值，但是产毒性大肠杆菌自身合成的野生型LT以及通过基因工程方式在大肠杆菌、 酵母或植物中表达的LT全毒素、突变体LTm或其亚单位的产率都较低，从而限制了 LT及其 突变体LTm的规模化生产和临床应用，这是本领域一个亟待解决的技术难题。 本专利技术通针对其特殊的基因结构，在重组质粒的构建过程中，通过一系列的载体 构建新策略，先分别高效表达LTA、LTB亚基，然后在体外优化的环境中高效装配成整体结 构，来获得可作为疫苗佐剂的突变体LTm全毒素，较好地克服了 LTm这一多亚基复杂蛋白对 其整体进行基因表达效能降低的问题，从而促进疫苗黏膜免疫佐剂的有效制备。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供。 本专利技术第二个目的在于提供大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm在制备疫苗佐剂中 的应用。 为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：大肠杆菌热敏感毒素突变 体本文档来自技高网...

【技术保护点】
大肠杆菌热敏感毒素突变体LTm的体外制备方法，其特征在于，在重组质粒的构建过程中，通过定点突变除去eltm序列中的Nde I酶切位点，将整段基因载入载体中，随后将包含信号肽序列两亚基基因eltA(+)和eltB(+)分别载入两个载体中，最后将不含信号肽序列两亚基基因eltA(‑)和eltB(‑)分别放入两个载体之中，构建pET24a‑eltm、pET24a‑eltA(+)、pET24‑eltB(+)、pET24a‑eltA(‑)与pET24a‑eltB(‑)五个重组质粒，通过各个重组质粒工程菌的表达量的对比，筛选出高表达量的工程菌，再通过亚基的体外装配以及装配条件的优化进而高效制备LTm。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马兴元，刘地，郭华，郑文云，王晓丽，李尚洁，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31