本发明专利技术公开了一种利用重组大肠杆菌直接从葡萄糖发酵生产反式-4-羟脯氨酸的方法，该方法是先将突变后的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)与连有色氨酸串联启动子的反式-4-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(hyp)重组到合适的载体上，构建proB2A与hyp的共表达体系，然后将此共表达体系导入到大肠杆菌中，得到的重组菌能够实现在无外源L-脯氨酸的条件下，能够高效的利用葡萄糖直接发酵生产反式-4-羟脯氨酸，从而降低了发酵生产反式-4-羟脯氨酸的成本，提高了经济效益。本发明专利技术还公开了所述大肠杆菌在羟脯氨酸生产中的应用。
【技术实现步骤摘要】
—种利用重组大肠杆菌无外源L-脯氨酸发酵生产反式-4-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
反式-4-轻脯氨酸(trans-4-hydroxy-L_proline，Hyp)是L-脯氨酸轻基化后的产物，是亚氨基酸的一种。反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中，因其有两个不对称碳原子而有四种立体异构体，是一个重要的手性合成元件，广泛应用于医药、化工、食品、美容等行业。随着反式-4-羟脯氨酸应用领域的不断扩展，其生产方法也在逐渐发生变化，目前主要的生产方法是水解法和微生物发酵法。其中，由于水解法过程复杂、产生大量废弃物、成本高等原因，逐渐被淘汰，而微生物发酵法能更好的解决这方面的问题，越来越受人们关注。微生物发酵法是通过生物细胞表达的脯氨酸-4-羟化酶，将游离的脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法。脯氨酸-4-羟化酶催化脯氨酸转化为羟脯氨酸的过程中，需要以亚铁离子作为催化辅因子，同时需要酮戊二酸和氧分子的参与。其中，在微生物体内，L-脯氨酸的生产过程是，由α-酮戊二酸形成的谷氨酸，经谷氨酸激酶(pr0B编码)催化下由ATP提供磷酸基团形成谷氨酰磷酸，又在谷氨酸脱氢酶(proA编码)作用下将谷氨酸的γ -羧基还原成谷氨酸-T -半醛，然后自发环化形成五元环化合物Λ ’ 二氢吡咯-5-羧酸，再由二氢吡咯还原酶(proC编码)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能够反馈抑制谷氨酸激酶，而且proB与proA是作为一个操纵子proBA进行表达的，将proBA突变成proB2A后能够降低脯氨酸的反馈抑制，大量生产L-脯氨酸。将谷氨酸激酶基因(ProB2A)与连有色氨酸串联启动子的反式-4-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(hyp)构建成共表达体系，转入到宿主菌中，获得含有该共表达体系的重组菌，能够在无外源L-脯氨酸的条件下，利用葡萄糖直接连续发酵生产反式-4-羟脯氨基酸，降低发酵生产成本，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在无外源L-脯氨酸的条件下，在微生物体内，提高利用葡萄糖直接连续发酵生产反式-4-轻脯氨基酸的产量，降低生产成本。本专利技术所述的利用重组菌发酵生产反式-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，将proBA突变成?抓84后，其编码的谷氨酸激酶能够降低L-脯氨酸的反馈抑制，与经优化后的连有色氨酸串联启动子的反式-4-羟脯氨酸的脯氨酸羟化酶基因(hyp)构建成合适的共表达体系，将该共表达体系转入到合适的宿主菌中，在无外源L-脯氨酸的条件下，能够高效的利用葡萄糖直接连续发酵生产反式-4-羟脯氨酸。本专利技术中的两种基因只有脯氨酸羟化酶基因(hyp)含有独立的高效启动子-色氨酸串联启动子(Ptrp2)，该启动子是从已有的重组载体上酶切获得。本专利技术中的proB2A、hyp共表达体系构建方法是，从已有的重组载体上酶切获得ProB2A，然后将其连接到含有pET28a-Ptrp2-hyp的重组载体上，获得pET28a-proB2A_Ptrp2-hyp，然后设计合适的酶切位点8&1^1、恥111，？0?获得片段?抓84-?壮?2-1^?(8!0，将片段冊通过酶切位点连接到pUC19上，获得共表达体系pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp。本专利技术中所用到的载体必须能够在宿主内独立复制，且插入的两种片段要都能够随着载体的复制而各自复制。本专利技术所述重组菌株在发酵反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，所述的重组菌株在合适的发酵培养基中，于合适的发酵条件下进行培养，依发酵获得的培养物、细胞体或它们的处理物作为酶源，依葡萄糖为底物，无需额外添加L-脯氨酸，高效利用葡萄糖直接连续发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸，与之前的发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法相比，能够降低发酵成本提高经济效益。其中，所用的发酵培养不仅要满足菌体的扩大生长的需求，而且要适合脯氨酸-反式-4-羟化酶基因的表达；用来羟基化L-脯氨酸的酶源不仅包括脯氨酸-反式-4-羟化酶基因直接编码合成的酶，还包括依该酶为基础，经修饰后的具有该酶类似催化活性的蛋白质。本专利技术所生产的反式-4-羟基-L-脯氨酸，将发酵液离心后，分布于上清液中，可通过适当的后处理手段获得结晶状的产品。本专利技术发酵液所生产的反式-4-羟基-L-脯氨酸，可通过氯胺-T法检测，也可以利用高效液相色谱法精确测定。【附图说明】图1是单一表达载体pET28a_BH的构建。图2是单一表达载体pUC19-BH的构建。图3是含单一表达载体菌株的获得。【具体实施方式】—般性说明:【具体实施方式】中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工，具体操作完全按照试剂盒的说明。LB培养基:Tryptone 10g/L,Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0_7.2ο发酵培养基:GlucoselOg/L,Tryptone 8g/L，K2HP043g/L，NaCl 2g/L,MgSO40.2g/L，FeSO4ImM ,CaCl20.015g/L。Amp抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Ampicillin sodiumsalt 100yg/mLoKan抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Kanamycin sulfate50yg/mLo5XKCM缓冲液:0.5M KC1，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2。反式-4-羟脯氨酸的测定方法:将发酵液离心后，取上清，稀释后取2.5mL于1mL试管中，加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:将1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为:将50g柠檬酸，26.3g NaOH和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200mL水以及300mL正丙醇混合)，摇勾后在室温中放置20min;然后加入ImL显色剂(显色剂:称取1g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇)，摇匀后迅速将试管置于60°C水浴锅中，20min后取出冷水冷却，用分光光度计在560nm波长处测定吸光度值。实施例1:含有proB2A的重组质粒(pET28a-proB2A)的获得将实验室冷冻保存的含有pET28a-pr0B2A的菌株进行活化，于37°C，220rpm培养12-16小时，取培养后的菌液按照sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒说明书提取质粒。实施例2:含有hyp的重组质粒(pUC19-Ptrp2_hyp)的获得将实验室冷冻保存的含有pUC19-Ptrp2-hyp的菌株进行活化，于37°C，220rpm培养12-16小时，取培养后的菌液按照sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒说明书提取质粒。实施例3:重组质粒 pET28a-proB2A-Ptrp2_hyp 的构建利用限制性内切酶EcoR1、BamHI从重组质粒pUC19-Ptrp2-hyp中获得片段Ptrp2-hyp ，然后用EcoR1、BamHI处理重组质粒pET28a_proB2A，将酶处理后的片段Ptrp2_hyp本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株在无外源L‑脯氨酸条件下发酵生产反式‑4‑羟脯氨酸的重组菌的构建方法，是将proB2A、Ptrp2‑hyp重组到质粒pUC19、pET28a上，构建重组质粒pUC19‑proB2A‑Ptrp2‑hyp(pUC19‑BH)、pET28a‑proB2A‑Ptrp2‑hyp(pET28a‑BH),然后该重组质粒转化到大肠杆菌中，实现proB2A、hyp在大肠杆菌中的共表达，该重组菌能够在无外源L‑脯氨酸条件下发酵生产反式‑4‑羟脯氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张震宇，姚动邦，王晓姣，黄建华，魏照辉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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