一种丁酸产量低且丁醇产量高的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种丁酸产量低且丁醇产量高的工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术提供了一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌的基因组上的硫酯酶基因yciA表达，得到重组菌。本发明专利技术通过将生产丁醇的出发菌EB228CGMCC No.11986基因组上的硫酯酶YciA基因yciA替换为FRT，得到重组菌，该重组菌发酵产生的丁酸产量明显下降，丁醇产量有较明显的上升，可以用于丁醇高产量生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种丁酸产量低且丁醇产量高的工程菌及其 构建方法与应用。
技术介绍
能源与环境是当今社会关注的焦点。随着化石能源的日渐枯竭和自然环境的污 染，人类对可再生能源的需求越来越强烈。利用微生物转化或发酵可再生资源高效生产可 再生能源是今后的能源发展趋势，这种通过生物法生产化学品的方式是可持续的且环境友 好的。 丁醇是一种重要的化工品和原料，可直接用作有机溶剂，是合成多种酯类化合物 的前体，广泛应用于各种塑料和橡胶制品中。同时，丁醇也是优良的可替代汽油的生物燃 料。它具有和汽油相当的热值与辛烷值，可与汽油以任意比例混合;在运输过程中，不易腐 蚀管道;与乙醇相比，其蒸汽压低，安全性高，因此是一种极具潜力的新型生物燃料。目前， 丁醇的年市场需求大约在百万吨级别。 丁醇可由生物合成是巴斯德于1861年首次发现的，1912年，魏兹曼(Weizmann)发 现了一种梭菌Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)能够将淀粉转化为丙酮、丁醇 及乙醇。之后，很多研究便集中于改造丙酮丁醇梭菌，以期得到可用于工业化生产丁醇的工 程菌株。但是，丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧生长的革兰氏阳性细菌，其遗传操作系统复 杂，不利于进行实验室的研究和工业的生产。2008年，Shota Atsumi,James C.Liao等首先 在大肠杆菌中实现了丁醇的合成（Atsumi S，Cann A F，Connor M R，et al .Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production.Metabolic engineering ,2008,10(6) :305-311 ·)，该研究组将丙酮丁醇梭菌体内的丁醇合成途径转移 至大肠杆菌内，致使其可产生少量丁醇。随后，该研究组对整条途径进行了优化，将以NADH 为还原力，催化可逆反应巴豆酰辅酶A生成丁酰辅酶A的丁酰辅酶A脱氢酶复合物（Bcd-EtfAB complex)替换为来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的催化不可逆反应的反 式烯酰辅酶A还原酶(Ter);催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A的酶，由乙酰乙酰辅酶A硫解 酶(Th 1)换为大肠杆菌中活性更强的乙酰辅酶A乙酰转移酶(AtoB)，由此形成了NADH和乙酰 辅酶A的驱动力，丁醇产量大幅度提高。 虽然，大肠杆菌可以通过梭菌的丁醇途径生产丁醇，但是，该过程往往伴随着一系 列副产物的产生，丁酸是其中占比例较大的副产物之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。 本专利技术提供的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA 表达，得到重组菌。 上述方法中，所述抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA表达 为敲除生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA。 上述方法中，所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因采用λ-r ed同源重组系统、sacB基因介导筛选的同源重组系统或CRI SPR/Cas系统。 上述方法中，所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因为采用 λ-red同源重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因替换为FRT;或所述敲除生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因为采用λ-red同源 重组系统将生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因替换为两端带有FRT的标记 基因； 所述FRT的核苷酸序列为序列17第59-106位。 上述方法中，所述标记基因为卡那霉素抗性基因； 所述两端带有FRT的标记基因片段的核苷酸序列为序列表中序列17第4H534位。 上述方法中，所述生产丁醇的出发菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌为将丙酮丁醇梭 菌体内的丁醇合成途径转移至出发大肠杆菌得到的菌； 所述大肠杆菌具体为EB228CGMCC No. 11986; 所述出发大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113。 上述方法中，所述硫酯酶的氨基酸序列为序列21; 所述硫酯酶yciA基因的核苷酸序列具体为序列7。 上述方法中，所述将生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因替换为 FRT的方法包括如下步骤： 1)将含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子导入EB228(pKD46)，得到yciA替换为两端带有FRT的卡那霉素抗性基因片 段的中间菌； 所述含有硫酯酶基因 yciA的上游同源臂、抗性基因和硫酯酶基因 yciA的下游同源 臂的同源DNA分子的核苷酸序列为序列17; 所述EB228 (pKD46)为将质粒pKD46导入EB228中得到的菌； 2)将质粒pCP20转入所述中间菌，使所述pCP20质粒上的FRT替换了中间菌中的卡 那霉素抗性基因，得到去除卡那霉素抗性基因的中间菌； 3)将所述去除卡那霉素抗性基因的中间菌先在37°C培养去除了温敏质粒pCP20和 PKD46，得到去除温敏质粒的中间菌； 4)将所述去除温敏质粒的中间菌分别在卡那霉素抗性培养基、氯霉素抗性培养 基、无卡那霉素且无氯霉素平板培养基中培养，选取只在所述无卡那霉素且无氯霉素平板 培养基上生长，且在所述卡那霉素抗性培养基和所述氯霉素抗性培养基均不生长的菌，为 重组菌； 所述将生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因替换为两端带有FRT的 标记基因的方法为所述将生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因 yciA基因替换为FRT的 方法中的步骤1)。由上述方法制备的重组菌也是本专利技术保护的范围。上述方法或上述重组菌在生产丁醇或提高丁醇产量中的应用也是本专利技术保护的 范围； 或上述方法或上述重组菌在生产丁酸或降低丁酸产量中的应用也是本专利技术保护 的范围。 或上述方法或上述重组菌在生产丁醇且降低副产物丁酸产量中的应用也是本发 明保护的范围。 本专利技术另一个目的是提供一种生产丁醇和/或丁酸的方法。 本专利技术提供的方法，包括如下步骤:发酵上述重组菌，得到丁醇和/或丁酸。 EB228菌已于2016年1月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心（简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏号为CGMCC No. 11986,分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。本专利技术的实验证明，本专利技术中可促进大肠杆菌生产丁醇的改造靶点为硫酯酶基因 yciA，通过λ-red同源重组系统敲除技术，在一株产丁醇的大肠杆菌EB228CGMCC No.11986 中将基因组上的硫酯酶基因 yciA替换为FRT，得到重组菌，与EB228CGMCC No. 11986相比，该 重组菌发酵产生的丁酸产量明显下降，丁醇产量有较明显的上升，可以用于丁醇高产量生 产。【附图说明】图1为EB228体内的丁醇生产途径。图2为基因敲除的过程示意图。图3为出发菌株与突变体菌株在小管中发酵的丁酸产量和丁醇产量。图4为EB228 Δ yciA发酵液使用高效液相色谱(HPLC)分析的结果示意图。图5为使用气质联本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建重组菌的方法，为抑制或沉默生产丁醇的出发菌基因组上的硫酯酶基因yciA表达，得到重组菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵春华，董红军，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11