基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法技术

本发明专利技术公开一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法。将烟酰胺核苷激酶基因与pet28a载体连接，构建表达载体，经低能离子束介导作用将表达载体导入大肠杆菌，从而获得产辅酶I重组大肠杆菌，本发明专利技术采用离子束介导作用技术将辅酶I合成途径中烟酰胺核苷激酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，使重组菌能够多产烟酰胺核苷激酶，从而大幅提高发酵产物辅酶I的含量。在5L发酵罐中其辅酶I产量最高可以达到10.28g/l，具有很高的经济应用价值和产业化前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于离子束生物技术和分子生物学领域，具体涉及离子束介导基因生产辅酶I方法。
技术介绍
在酶的六大类型中，有百分之三十左右是氧化还原酶，氧化还原酶在在制药、食品、精细化工、农药等领域具有重要的用途，它的应用也越来越受到人们的重视，而大部分氧化还原酶催化作用的发挥需要烟酰型辅酶的参与，辅酶I在生物氧化过程中起递氢作用，活化各种酶系统，促进核酸、蛋白质、多糖的合成及代谢，增加物质转运和调节控制，改善代谢功能。NAD+和NADH的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多，每克辅酶I大约要700元左右，由于氧化还原酶应用广泛而辅酶价格昂贵，使得辅酶工业化生产逐渐成为研究热点。1986年，受离子注入材料表面改性研究的启发，中国科学院等离子体物理研究所与安徽省农科院水稻所合作将低能离子注入应用于水稻的品种改良，获得极大的成功。随后离子注入被用于微生物和农作物的基因组改良，大量研究表明低能离子与生物体之间具有动量传递、能量沉积、粒子注入和电荷交换的过程。离子束介导是通过一定剂量和能量的离子束对细胞壁的溅射作用在破坏细胞壁或细胞膜上产生微孔通道，促进外源遗传物质进入细胞；其次，用于注入的带正离子降低了细胞表面的负电性，从而减弱了对带负电的外源DNA的排斥力,从而促进了外源DNA的吸附和进入。再者，离子束可以直接和间接的打断细胞内的双链DNA，以便外源DNA的整合和重组。众所周知，很多疾病的起因大多是因为体内糖、脂肪和蛋白质代谢不良而引起，而辅酶I是参与体内乙酰化反应、氧化还原反应和能量代谢的关键辅酶，对体内糖、脂肪和蛋白质代谢起重要作用。如何强化上述糖、脂肪和蛋白质代谢已成为药物研发主攻方向之一。现在国内外主要通过提取法、发酵法、生物合成法、强化法、和有机合成法等方法制备辅酶I。国内一直利用离子交换树脂从酵母中生产辅酶I，但是产品得率和纯度较低，虽然工艺成熟，但是耗费大量能源和材料，以及原料的昂贵，使得辅酶I的生产和后续产品研发收到了极大限制，大肠杆菌因培养条件简单、遗传背景清楚、生长快、发酵周期短、等诸多优点，在基因工程领域成为使用最广泛的宿主菌，基因工程菌株大量表达合成原本在野生菌株中不能或微量表达的蛋白和不能合成的有机化学品。而实现产品的工业化生产与成熟的重组菌发酵工艺是紧密相关，不可逾越的，因此实现基因工程技术和工程菌的发酵工艺的有机结合，无疑会为重组产品实现大规模生产奠定基础。尽管许多微生物在自然状态下都能产辅酶I，但绝大多数的辅酶产量极低，而通过常规育种技术耗时费力，难以筛选到产辅酶I的高产菌株，这就造成了生产成本居高不下，限制了其工业化生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，以克服现有技术的不足，提供一种新的辅酶I生产技术，可大幅提高发酵液中辅酶I的含量，其含量可以稳定在10g/L。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，包括如下步骤：1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；a)将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；b)利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆菌；c)将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。步骤1）所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhiziumrobertsii）ARSEF23的NRK基因片段MAA_05394，所述载体为pet28a。步骤2）中离子束介导的能量为14~18KeV，剂量（80~200）×1014ions/cm2，靶室真空度为（1.0~2.0）×10-3Pa。优选为离子束介导的能量为18KeV，剂量170×1014ions/cm2，靶室真空度为1.6×10-3Pa。步骤3）选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。步骤4）中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源0.5-1%，无机盐0.01-0.1%，生长因子0.1-0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种；氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种；无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种；生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至少一种。步骤4）中发酵采用高密度发酵，接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34℃，摇床转速为200-250r/min。接种后检测OD在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG诱导培养12-16h后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h。其中表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。有益效果：本专利技术将烟酰胺核苷激酶基因基因片段，经分子生物学手段构建表达载体，通过离子束介导方法将表达载体导入大肠杆菌，得到遗传稳定性良好的高产辅酶I的重组大肠杆菌，可以大幅提高发酵过程中辅酶I的含量；相对于传统技术，由于离子束射程的可控性和可聚束的特点，可精确控制被刻蚀受体表面形成转基因通道的直径和深度，有利于外源基因转移、整合和表达而且离子束的溅射属于冷加工范畴，与传统转到技术相比，加工精度高，可以不伤及邻近组织和细胞器。本专利技术所导入的烟酰胺核苷激酶可以高效的将底物腺嘌呤和烟酰胺转化成产物辅酶I，在发酵后期添加阴离子表面活性剂，可以将胞内的辅酶I泄露到细胞外，这样可以省去传统方法中需要使用昂贵破壁设备，大大节约了生产成本，易于后期的分离提取。具体实施方式下面结合具体实施实例对本专利技术做进一步描述，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1本实施例说明基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌的方法1、设计合成带有EcoRI酶切位点的上游引物和带有BamHI酶切位点的下游引物（下划线部分为相应的酶切位点），Primer1上游引物：5’-CGGAATTCATGCCCAAATCCCTCATAATAGG-3’；Primer2下游引物：5’-CGGGATTCCTATGGGTGCTTCCTCAGTT-3’。2、以MetarhiziumrobertsiiARSEF23基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段MAA_05394(GeneID:19259680)，反应条件为：95℃，5min；(95℃3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。

【技术特征摘要】
1.一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，包括以
下步骤：
1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；
将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；
利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以高效表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆
菌；
将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。
2.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方
法，其特征在于，步骤1）所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium
robertsii）ARSEF23的NRK基因片段MAA_05394，所述载体为pet28a。
3.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方
法，其特征在于，步骤2）中离子束介导的能量为14~18KeV，剂量为（80~200）×1014ions/cm2，
靶室真空度为（1.0~2.0）×10-3Pa。
4.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方
法，其特征在于，步骤3）选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。
5.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方
法，其特征在于，步骤4...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞龙，吴奎，吴晓菲，杜玉英，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32