本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌构建方法，包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆；（2）PCR基因扩增；（3）遗传转化；转化子筛选和蛋白表达。蛋白酶活性测定结果显示，本发明专利技术所构建的毕赤酵母基因工程菌可以生产较高产量较高活性的中性蛋白酶，毕赤酵母基因工程菌还可以用来工业化的规模生产中性蛋白酶，从而降低蛋白饲料添加剂的生产成本，提高养殖效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌构建方法。
技术介绍
蛋白酶是一种重要的工业用酶，能催化蛋白质肽键水解，在饲料生产和加工、食品等领域中具有重要的应用价值。中性蛋白酶是指其最适作用pH介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，被广泛地应用于饲料、食品等行业。相比碱性蛋白酶或酸性蛋白酶，中性蛋白酶的pH适应范围为中性，应用范围更广，在饲料加工中优点明显。例如豆粕等含蛋白质丰富的物质是重要的饲料、食品蛋白质原料，但这些大分子的蛋白质不容易被动物消化吸收，经过中性蛋白酶处理后，能水解大豆蛋白成小分子肽，降低了粘度，提高了溶解度，使其易为动物消化吸收，大大提高了豆粕中生物效价，改善了大豆分离蛋白的功能特性。如果将中性蛋白酶加入饲料配方中或直接与混合饲料混合饲喂，可提高蛋白质的利用率和降低饲养成本。中性蛋白酶也可用于以豆粕、玉米蛋白、花生饼和各种肉类等为原料，通过酶法水解将蛋白质水解成氨基酸或短肽，制备营养型的食品添加剂等。豆粕等植物蛋白被用来发酵制备生产动物用的蛋白饲料添加剂，豆粕中的大分子蛋白、抗原蛋白等需要用蛋白酶进行降解后，才能被动物高效吸收利用，降低动物的应激反应。但是目前生产上用的中性蛋白酶效果不佳，在产量和酶活方面都需要改进，继续开发一种可生产较高产量较高活性的中性蛋白酶得酵母基因工程菌。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌构建方法，该方法所得的毕赤酵母基因工程菌可生产较高产量较高活性的中性蛋白酶。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens，JCM20195）中克隆中性蛋白酶，该中性蛋白酶的基因序列如SEQIDNO.1所示；（2）PCR基因扩增：根据步骤（1）中所述中性蛋白酶的基因序列设计PCR引物：上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示；配置PCR反应体系，按下列顺序依次加样：无菌水74μL、解淀粉芽孢杆菌基因组模板（20195）2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTPs10μL、10×pfubuffer10μL和Pfu2μL，得PCR反应试剂；将所得PCR反应试剂放入PCR反应仪进行基因扩增，循环30次，再在72℃条件下延伸10min，将所得目的基因置于4℃条件下保存；所述PCR反应仪的参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性40s，45-60℃退火40s，72℃延伸3min10s；（3）遗传转化：将步骤（2）中所得的目的基因回收，分别用Not1和EcoR1双酶切目的基因和载体pPIC9K，连接，转化大肠杆菌，获得含有目的基因的重组质粒pPIC9K-gene，经测序确认后，将重组质粒用Sac1进行线性化，乙醇沉淀，利用电转化方法，转入到毕赤酵母感受态细胞中；（4）转化子筛选和蛋白表达：挑选带有目的基因的毕赤酵母菌落接种于1.5mg/L和1mg/L遗传霉素的平板上，选取PCR鉴定为阳性转化子的菌落；挑阳性转化子菌落于培养基BMGY，保存菌种；再挑阳性转化子菌落于培养基BMMY中，加入5%甲醇进行连续七天的诱导表达，得产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌；所述培养基BMGY组成如下：eastextract1%，Peptone2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB1.34%，Biotin(4×10-5)%，Glycerol1%；所述培养基BMMY组成如下：Yeastextract1%，Peptone2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB1.34%，Biotin(4×10-5)%，methanol3%。本专利技术有益效果：本专利技术所得毕赤酵母基因工程菌可生产较高产量较高活性的中性蛋白酶，本专利技术毕赤酵母基因工程菌所产生的高活性中性蛋白酶可以用来进行动物蛋白饲料添加剂的发酵处理，提高消化率、降解率、提高饲料的营养价值，降低动物的应激反应。毕赤酵母基因工程菌可以用来工业化的规模生产中性蛋白酶，从而降低蛋白饲料添加剂的生产成本，提高养殖效益。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体说明。实施例1:本实施例提供一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens，JCM20195）中克隆中性蛋白酶，该中性蛋白酶的基因序列如SEQIDNO.1所示；（2）PCR基因扩增：根据步骤（1）中所述中性蛋白酶的基因序列设计PCR引物：上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示；配置PCR反应体系，按下列顺序依次加样：无菌水74μL、解淀粉芽孢杆菌基因组模板（20195）2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTPs10μL、10×pfubuffer10μL和Pfu2μL，得PCR反应试剂；将所得PCR反应试剂放入PCR反应仪进行基因扩增，循环30次，再在72℃条件下延伸10min，将所得目的基因置于4℃条件下保存；所述PCR反应仪的参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性40s，45-60℃退火40s，72℃延伸3min10s；（3）遗传转化：将步骤（2）中所得的目的基因回收，分别用Not1和EcoR1双酶切目的基因和载体pPIC9K，连接，转化大肠杆菌，获得含有目的基因的重组质粒pPIC9K-gene，经测序确认后，将重组质粒用Sac1进行线性化，乙醇沉淀，利用电转化方法，转入到毕赤酵母感受态细胞中；（4）转化子筛选和蛋白表达：挑选带有目的基因的毕赤酵母菌落于96孔板中，进行遗传霉素抗性筛选接种于1.5mg/L和1mg/L遗传霉素的平板上获得2个菌落（克隆1、克隆2），进行PCR鉴定后为阳性转化子；挑阳性转化子菌落于培养基BMGY，保存菌种；再挑阳性转化子菌落于培养基BMMY中，加入5%甲醇进行连续七天的诱导表达，得产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌；所述培养基BMGY组成如下：eastextract1%，Peptone2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB1.34%，Biotin(4×10-5)%，Glycerol1%；所述培养基BMMY组成如下：Yeastextract1%，Peptone2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB1.34%，Biotin(4×10-5)%，methanol3%。蛋白酶活性测定：将实施例1中所得具有中性蛋白酶活性的毕赤酵母基因工程菌利用酪蛋白法进行蛋白酶活性测定。1．酪蛋白溶液配制：精确称取酪素2.000g，先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却后移入100ml容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。酪蛋白溶液可在4℃保存一周，变质后不能使用。2．标准酪氨酸曲线的绘制1）精确称取L—酪氨酸（先在105℃干燥2~3Hr）100mg小心地溶于60ml，0.1mol/LHCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，JCM20195）中克隆中性蛋白酶，该中性蛋白酶的基因序列如SEQ ID NO.1所示；（2）PCR基因扩增：根据步骤（1）中所述中性蛋白酶的基因序列设计PCR引物：上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示；配置PCR反应体系，按下列顺序依次加样：无菌水74μL、解淀粉芽孢杆菌基因组模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTPs10μL、10×pfu buffer 10μL和Pfu 2μL，得PCR反应试剂；将所得PCR反应试剂放入PCR反应仪进行基因扩增，循环30次，再在72℃条件下延伸10min，将所得目的基因置于4℃条件下保存；所述PCR反应仪的参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性40s，45‑60℃退火40s，72℃延伸3min10s；（3）遗传转化：将步骤（2）中所得的目的基因回收，分别用Not1和EcoR1双酶切目的基因和载体pPIC9K，连接，转化大肠杆菌，获得含有目的基因的重组质粒pPIC9K‑gene，经测序确认后，将重组质粒用Sac1进行线性化，乙醇沉淀，利用电转化方法，转入到毕赤酵母感受态细胞中；（4）转化子筛选和蛋白表达：挑选带有目的基因的毕赤酵母菌落接种于1.5mg/L和1mg/L遗传霉素的平板上，选取PCR鉴定为阳性转化子的菌落；挑阳性转化子菌落于培养基BMGY，保存菌种；再挑阳性转化子菌落于培养基BMMY中，加入5%甲醇进行连续七天的诱导表达，得产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌；所述培养基BMGY组成如下：east extract 1%，Peptone 2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB 1.34%，Biotin 4×10‑5 %，Glycerol 1%；所述培养基BMMY组成如下：Yeast extract 1%，Peptone 2%，pH=6.0的磷酸钾缓冲液100mmol/L，YNB 1.34%，Biotin 4×10‑5 %，methanol 3%。...
【技术特征摘要】
1.一种产中性蛋白酶的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）中性蛋白酶基因克隆：从解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens，JCM20195）中克隆中性蛋白酶，该中性蛋白酶的基因序列如SEQIDNO.1所示；（2）PCR基因扩增：根据步骤（1）中所述中性蛋白酶的基因序列设计PCR引物：上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示；配置PCR反应体系，按下列顺序依次加样：无菌水74μL、解淀粉芽孢杆菌基因组模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dNTPs10μL、10×pfubuffer10μL和Pfu2μL，得PCR反应试剂；将所得PCR反应试剂放入PCR反应仪进行基因扩增，循环30次，再在72℃条件下延伸10min，将所得目的基因置于4℃条件下保存；所述PCR反应仪的参数设置为：94℃预变性5min，94℃变性40s，45-60℃退火40s，72℃延伸3min10s；（3）遗传转化：将步骤（2）中所得的目的基因回收，分别...
【专利技术属性】
技术研发人员：章亭洲，狄香君，高仁钧，朱廷恒，
申请(专利权)人：浙江科峰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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