本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明专利技术所述的核酸检测靶序列的拷贝数是恒定的单拷贝，而且在种间高度特异，种内高度同源，适于作为番茄内标准基因。本发明专利技术所述的具有SEQ?ID?NO：1序列的核酸检测靶序列可制备成常规的重组质粒及转入所述重组质粒的工程菌和检测番茄的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由SEQ?ID?NO：2-4组成，可广泛应用于对番茄和转基因番茄及其加工产品的定性和定量检测，且具有特异性高，重复性好的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种番茄的核酸检测方法。
技术介绍
随着转基因作物及转基因食品(genetically modified crops/food, GMCs/GMF) 的产业化，其安全性问题逐渐受到广泛关注，各国政府相继出台转基因作物的系列法规、 标准，用以规范GMCs/GMF的研发、生产、上市和贸易流通。欧盟、中国等实行GMCs/GMF的转基因成分标识制度，对转基因植物检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求。转基因植物基体标准物质和核酸分子标准物质的研制，以及转基因植物定性、定量检测技术研究已成为当前的研究热点，并逐步向国际标准化方向发展。番茄作为重要的GMCs/GMF 之一，在我国已被列入第一批实施标识管理的农业转基因生物(genetically modified organisms, GMOs)目录，建立可与国际接轨的番茄转基因成分标准化检测手段，已是必需。 目前国际上对转基因番茄鉴定方法的研究仍处于起步阶段，对番茄内标准基因的研究报道较少，仍有待研究。内标准基因，是某种植物中具有种间特异性，种内非特异性，低拷贝数特征的一类基因。特定物种的内标准基因是区别其他物种的遗传标志，可用于物种及其产品鉴别、转基因成分检测等诸多领域。内标准基因用于植物基因组DNA的质量或者拷贝数的定量分析， 并且对于转基因的定量检测起着决定性的作用。没有合适的内标准基因是不可能对于转基因植物及其加工产品进行定量分析的，也不能确定转基因植物及其加工产品的准确的转基因含量。寻找、鉴定适宜的内标准基因对转基因作物的检测而言至关重要。番茄内标准基因的研究较玉米、大豆、棉花等农作物略有滞后，国内外的相关报道不多。Mason等在2002 年报道基于番茄apx基因(GenBank Accession No. Y16773)以qPCR方法可估算转基因番茄插入外源基因的量值。深入鉴定具有高度番茄种特异性的内标准基因，进行拷贝数验证及检测体系的特异性、稳定性分析，以建设稳定的具有高度番茄种特异性的内标准检测体系，仍是目前需要解决的重要问题。构建番茄内标准基因核酸检测体系对转基因番茄及其加工产品的定性、定量PCR检测和其生产过程中外源基因拷贝数的测定方面发挥着极其重要的作用。其不但可以对番茄原料，而且对于如番茄酱、番茄饮品等难以从外观上区分的番茄加工品进行定性的检测。对于经过定性检测呈阳性的样品进一步的使用内标准基因为参照的定量PCR的检测如筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测，最后通过外源目的基因的拷贝数和番茄内标准基因组拷贝数的比值获得外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种稳定的具有高度番茄种特异性的核酸检测靶标区域的番茄靶基因，该靶基因的拷贝数低且稳定，而且在种间高度特异，种内高度同源，适于作为番茄内标准基因。本专利技术为解决上述技术问题的方案是—种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该靶序列的序列为，TCTATAAGTG AACTTAACCT TGTCAAGATT TAAATTACTTATTAAGTGAA ATCTGAATAT ATGATTATAT TAACCTTGCCAGGACAAGCC AGAGCCACCA GTGGAAGGTC GCTTGCCGGATGCCACCAAG GGTATGATAG ACTGATAACT TATAGAGCAGATTTTGATTG CAAAACTCCT GTTGAGGAAC ATATTTTTCTTGCAATTTAC CTGTCTTGGT AATCATATGT AATACCTAATGCAGGCTGTG ACCACTTGAG AGACGTGTTC AAGAAACAAATGGGTCTTTC TGACCAGGAT ATTGTTGCAC TCTCTGGTGCCCATACCTTG GTTTGTTGCC TGTTCTTAAT GTTTAATCTTATTTTTTGCT AGGTTCTATT CCTATATGCT TATTTCTTAGTGATATTTTT CCAGGGAAGG GCACACAAGG AGCGTTCTGGTTTTGAAGGA CCTTGGACTG CCAATCCCCT TATCTTTGACAATTCATACT TCACGTAATG ATACTGAAGT TACACATCTTTTTTCAGTTC TCCATTTTGT GGAACTTGTT CATTTGTGGAGTACTGTTTA ACTGCTAACT AT(SEQ ID NO. 1)。上述核酸检测靶序列的分子量为582bp，分子类型为DNA。本专利技术所述的靶基因制备方法如下1)分别提取出凤梨、红运6、花城、金丰、金福、金禧、玛利亚、美嘉、蒙罗丽莎、魔域、年丰、夏丰、新铁甲、中原988和益丰15种番茄的总gDNA，并以其为模板，再以5’ -F GTGATTGTTCTCCGTTATGC-3，为上游引物，以 5，-R TGGGACTGATGATAGTTAGC-3‘为下游引物， 按常规PCR进行扩增，获得每一种番茄的扩增片段，其扩增程序为98°C变性IOmin后进入循环，98°C 15s，55°C 15s，72°C 30s，共 30 个循环，最后一步为 72°C IOmin 延伸；2)回收并纯化每一种番茄(共15种)的扩增片段，然后送交广州英俊公司和华大基因公司分别进行三次双向测序，以DNAMAN等生物信息学软件分析，取该扩增片段中15种番茄均呈现同源性100%的区域的DNA序列，即获得SEQ ID NO. 1所示的靶序列。本专利技术所述的靶基因的拷贝数鉴定采用Southern blot和双重荧光定量PCR技术鉴定，证实其在9种不同地域来源的国内外番茄品种中均呈单拷贝，因此它适于作为番茄内标准基因进而制成质粒标准分子或标准物质，对番茄和转基因番茄及其加工产品的定性和定量检测。其中，所述的质粒标准分子可以是常见的重组质粒，即选用市售的质粒，如 pEasy-T3等，按常规基因克隆方法插入SEQ ID NO. 1所示靶标核酸序列的重组质粒；所述的标准物质可以是上述的质粒标准分子，亦可以是常见的工程菌菌株，如将上述重组质粒 (质粒标准分子)转入E. coli等工程菌所得到的菌株。本专利技术所述的核酸检测靶序列及含该靶序列的重组质粒可进一步开发成定性和定量检测番茄的试剂盒，该试剂盒的具体方案如下一种检测番茄的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、阴性对照品、 DNA聚合酶、引物和荧光探针组成，其特征在于(1)所述的引物为扩增SEQ ID NO. 1所示靶序列的引物，其中，上游引物序列为5，-ACATATTTTTCTTGCAATTTACCTG-3，(SEQID NO. 2)下游引物序列为5，-CTGGTCAGAAAGACCCATTTG-3，(SEQID NO. 3)(2)所述的荧光探针序列为5，HEX-CGTCTCTCAAGTGGTCACAGCCTG-BHQ13，(SEQ ID NO. 4)其中 HEX 标记的是标记探针5’端的荧光基团，BHQl是标记探针3’端淬灭基团；(3)所述定量阳性模板是含序列为SEQ ID NO. 1的DNA片段的重组质粒。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该靶序列的序列为，ＴＣＴＡＴＡＡＧＴＧ ＡＡＣＴＴＡＡＣＣＴ ＴＧＴＣＡＡＧＡＴＴ ＴＡＡＡＴＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＡＡ ＡＴＣＴＧＡＡＴＡＴ ＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴ ＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＣ ＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ ＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣ ＧＣＴＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＣＡＡＧ ＧＧＴＡＴＧＡＴＡＧ ＡＣＴＧＡＴＡＡＣＴ ＴＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧ ＣＡＡＡＡＣＴＣＣＴ ＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣ ＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＡＴＴＴＡＣ ＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴ ＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴ ＡＡＴＡＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧ ＡＣＣＡＣＴＴＧＡＧ ＡＧＡＣＧＴＧＴＴＣ ＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣ ＴＧＡＣＣＡＧＧＡＴ ＡＴＴＧＴＴＧＣＡＣ ＴＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＡＣＣＴＴＧ ＧＴＴＴＧＴＴＧＣＣ ＴＧＴＴＣＴＴＡＡＴ ＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴ ＡＧＧＴＴＣＴＡＴＴ ＣＣＴＡＴＡＴＧＣＴ ＴＡＴＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴ ＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧ ＧＣＡＣＡＣＡＡＧＧ ＡＧＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡ ＣＣＴＴＧＧＡＣＴＧ ＣＣＡＡＴＣＣＣＣＴ ＴＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＣＴ ＴＣＡＣＧＴＡＡＴＧ ＡＴＡＣＴＧＡＡＧＴ ＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣ ＴＣＣＡＴＴＴＴＧＴ ＧＧＡＡＣＴＴＧＴＴ ＣＡＴＴＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＴＴＡ ＡＣＴＧＣＴＡＡＣＴ ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周晓红，麦荣嘉，陈晓光，周伦彬，胡良勇，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。