从新HCV株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的复制子-复制细胞制造技术

从新的暴发性丙型肝炎病毒株来源的基因、使用该基因获得的具有高复制效率的ＨＣＶ复制子ＲＮＡ、以及用该复制子ＲＮＡ转染的ＨＣＶ复制子－复制细胞。通过使用如上所述的ＨＣＶ复制子ＲＮＡ和ＨＣＶ复制子－复制细胞，可以连续大量产生ＨＣＶ蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从新的暴发性丙型肝炎病毒株衍生的核酸和基因、使用该基因的HCV复制子和复制子-复制细胞。
技术介绍
对于病毒研究和抗病毒药物的研究和开发，允许病毒有效扩增的实验体系绝对是必需的。另外，当具有通过使用培养细胞扩增病毒的体系或通过使用培养细胞评价病毒增殖的体系时，病毒研究和抗病毒药物的研究和开发显示出引人注目的进展。丙型肝炎病毒(HCV)是属于黄病毒科、以单链(+)有义链RNA为基因组的病毒，并已知其导致丙型肝炎。近来的研究已揭示，可以根据基因型或血清型将丙型肝炎病毒分类为许多类型。根据Simmonds等人利用HCV株核苷酸序列所作的系统分析方法(该方法是目前HCV基因型分类的主流方法)，将HCV分成六个类型，即基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a和基因型3b，且这些类型的每一个进一步分为若干亚型(Simmonds，P.等人，Hepatorigy，(1994)10，第1321-1324页)。目前已经确定了许多HCV基因型的全长基因组核苷酸序列(Choo等人，Science，(1989)244，第359-362页；Kato等人，J.Med.Virol.，(1992)第334-339页；Okamoto，H等人，J.Gen.Virol.，(1992)73，第673-679页；Yoshioka等人，Hepatorogy，(1992)16，293-299)。目前主要采用干扰素-α、干扰素-β和干扰素-α与嘌呤核苷衍生物三氮唑核苷(ribabirin)的组合治疗来治疗丙型肝炎。然而，即使是进行这些治疗后，在所有接受治疗的患者中也仅约60％观察到治疗效果，且停止治疗时，超过半数的有效果的患者疾病复发。已知干扰素的治疗效果与HCV基因型相关，并且据说其对基因型1b的效果低而对基因型2a的效果较高(Mori，S.等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，(1992)183，334-342)。开发有效的丙型肝炎治疗药物或预防药物是巨大的挑战，其中丙型肝炎在工业国具有高发病率并最终导致严重结果，且目前对其尚无病因疗法。因此，迫切期待HCV特异性化学疗法或疫苗疗法的进展并开发抗HCV药物。作为开发抗HCV药物的目标，可设想抑制HCV复制或抑制HCV感染细胞。由于直至最近难以在细胞培养体系中增殖HCV和用HCV感染培养的细胞，而且可以被HCV感染而且进行实验的动物仅限于黑猩猩，所以对于HCV复制机制和HCV感染机制的研究仍然困难。然而，近来已制得了衍生自HCV并具有自主复制能力的RNA这样的HCV亚基因组RNA复制子(JP专利公开(Kokai)No.2001-17187(2001)；Lomann等人，Science，(1999)285，110-113；Blight等人，Science，(2000)290，1972-1974；Friebe等人，(2001)75，12047-12057；Ikeda等人，J.Virol.，(2002)76(6)，2997-3006)，由此可以使用培养的细胞来分析HCV的复制机制。这些HCV亚基因组RNA复制子是这样的RNA复制子其中存在于HCV基因组RNA 5′非翻译区中HCV IRES下游的结构蛋白被新霉素抗性基因和连接在其下游的EMCV-IRES取代，其中所述HCV基因组RNA来自属于基因型1b、被称为Con 1的克隆。已经证实，通过将这些复制子RNA导入人肝癌Huh7细胞并在新霉素存在下进行培养，它们在Huh7细胞中自主复制。认为使用该RNA复制子系统的HCV复制评估体系将成为开发抗HCV药物的有力工具。据报道，基因型不同的HCV中编码的病毒蛋白也不同，且可以想象，仅通过分析衍生自基因型1b HCV的亚基因组RNA复制子难以充分阐明HCV的复制机制。另外，因为干扰素的治疗效果依赖于HCV基因型，所以认为仅通过使用含有HCV基因型1b亚基因组RNA复制子的HCV复制体系开发对多种类型HCV发挥效果的抗HCV药物尤其困难。因此，认为应当通过制备许多基因型的HCV RNA复制子来进行关于HCV复制机制和抗HCV药物的研究。目前，仅有若干克隆株系能够作为复制子在培养的细胞中复制。另外，从慢性肝炎克隆并经证实对黑猩猩有传染性的克隆并不必要能够作为复制子复制(Lomann等人，Science，(1999)285，110-113)。即，尚未发现可以以卓越的复制效率以及高概率产生HCV复制子的HCV株选择方法，而当建立起这样的HCV株选择方法时，HCV治疗药物的研究和开发有望得到巨大进展。目前尚未对HCV开发出疫苗。对此的理由之一是不能以体内大量存在的形式稳定地产生能够作为疫苗的HCV相关蛋白。由于在上述HCV复制子细胞中表达HCV相关蛋白(JP专利公开(Kokai)No.2001-17187(2001))，所以预期可以使用该HCV复制子细胞。然而，有必要使用能够大量培养用于疫苗工业生产的细胞。从该角度看，目前建立的唯一的HCV RNA复制子-复制细胞Huh7细胞似乎不适于疫苗生产。对于适于疫苗生产的细胞，可以考虑能够在悬浮培养体系中以非常巨大的量培养的细胞，例如HeLa细胞。此外，由于HCV的序列依赖上述基因型而不同，所以需要为每个基因型生产疫苗。换言之，需要使用适于疫苗生产的细胞产生多个基因型的HCVRNA复制子细胞。另一方面，因为对HCV感染的易感性尚未得到证实，所以也认为Huh7细胞不适于建立使HCV能够自主感染并复制的细胞培养体系。由此，认为使用其它肝癌细胞建立使HCV自主感染并复制的细胞培养体系是必需的。而且，可能通过比较HCV RNA复制子在多种细胞中复制机制的差异而鉴定对于HCV复制所必需的细胞因子，这有望导致发现抗HCV治疗药物的新靶。
技术实现思路
本专利技术目的是提供具有卓越的高概率复制效率的HCV复制子RNA以及能连续大量产生HCV蛋白的HCV复制子细胞。作为旨在解决上述问题的勤奋研究的结果，通过发现可以使用从暴发性丙型肝炎患者HCV株JFH2.1或JFH2.2衍生的复制子获得具有卓越的高概率复制效率的复制子-复制细胞，本专利技术人完成了本专利技术。即，本专利技术提供由多核苷酸(a)、(b)或(c)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(c)在严格条件下与由同上述(a)或(b)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白的多核苷酸， 前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。本专利技术也提供下列核酸(1)至(6)作为上述核酸的实例。(1)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，(2)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
由多核苷酸（ａ）、（ｂ）或（ｃ）组成的核酸：　　　　（ａ）含有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１、ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３和ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：４所示核苷酸序列的多核苷酸；　　　　（ｂ）含有ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２、ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：５和ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：６所示核苷酸序列的多核苷酸；及　　　　（ｃ）在严格条件下与由同所述（ａ）或（ｂ）核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码ＨＣＶ蛋白的多核苷酸，　　　　前提是，如果该核酸为ＤＮＡ，那么序列表中的核苷酸符号“ｕ”应当以“ｔ”取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：胁田隆字，加藤孝宣，伊达朋子，宫本道子，
申请(专利权)人：财团法人东京都医学研究机构，东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]