本发明专利技术提供有效复制含全长HCV基因组序列的RNA的方法和使用细胞培养系统生产含全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的HCV病毒颗粒的方法。此外，本发明专利技术涉及生产丙型肝炎病毒颗粒的方法，其包括培养其中导入复制子RNA的细胞，并在培养基中产生病毒颗粒，其中所述复制子RNA包含的核苷酸序列含有基因型2a丙型肝炎病毒的全长基因组RNA序列、至少一种选择标记基因和/或至少一种报告基因以及至少一种IRES序列，或含有基因型2a丙型肝炎病毒的全长基因组RNA。再进一步，本发明专利技术还涉及丙型肝炎疫苗和抗丙型肝炎病毒颗粒的抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及含丙型肝炎病毒全长基因组的核酸构建物、生产丙型肝炎病毒颗粒的体外方法和所生产的丙型肝炎病毒颗粒的用途。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科家族，是一种具有单链正义RNA基因组的病毒， 已知引起丙型肝炎。HCV通过持续感染引起慢性肝炎。目前，在世界范围内观察到的慢性肝炎的重要病因是持续HCV感染。实际上，大约50%的持续感染个体发展成慢性肝炎。这些患者约有 20%在10-20年间由慢性肝炎转变成肝硬化，这些患者中有一些进一步发展成晚期致死性病症，例如肝癌。丙型肝炎目前主要通过使用干扰素-α或干扰素-β的疗法或使用干扰素-α和利巴韦林(一种嘌呤-核苷衍生物)组合的疗法治疗。但是，即使在实施这些疗法时，在所有受治疗患者中也仅有约60%观察到疗效。当观察到疗效后终止治疗时，一半以上的患者疾病复发。一个重要目标是开发有效对抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂。在工业化国家丙型肝炎发病率高，最终引发严重后果，目前还没有可用的病因疗法。因此，需要开发HCV-特异性化学疗法和疫苗疗法。开发抗HCV药物的目标可为抑制HCV复制或抑制HCV感染细胞。最近，已制备了 HCV亚基因组RNA复制子系统，作为HCV衍生的自主复制RNA (参见特许文献1、2和3，非特许文献1-4)。在HCV亚基因组RNA复制子系统中，制备其中HCV 基因组结构基因被去除并被药物选择性标记基因取代的HCV复制子RNA，并将其导入培养细胞中，由此使复制子RNA在细胞中自主复制。使用这些系统使得有可能分析HCV的复制机制。但是，这是一个其中仅可在HCV病毒增殖和复制过程中评价病毒RNA复制的实验系统，不能分析被感染细胞中HCV病毒颗粒形成和胞外释放或感染另一细胞的过程。此时，只能在使用动物如黑猩猩的实验系统中评价HCV病毒颗粒形成和胞外释放以及感染另一细胞的过程(非特许文献幻。但是，使用活生物(例如动物)的实验系统很复杂，非常难分析。因此，为了分析HCV病毒颗粒形成和胞外释放以及感染另一细胞的过程， 为了生产具有抑制该过程的作用机制的抗HCV药物，必须建立重现该过程的高度简单化的实验系统，即在细胞培养实验系统中的HCV病毒颗粒生产系统。此外，一旦可使用细胞培养系统稳定提供HCV病毒颗粒，就有可能使用分子生物学技术对病毒减毒或生产非感染性HCV病毒，这可用于疫苗。特许文献1 日本特许公开(公报)第2001-17187号特许文献2 国际专利申请PCT/JP03/15038特许文献3 JP特许申请第2003-3^082号非特许文献1 :Lohmann 等，Science, (1999)沘5，110-113 页非特许文献2 =Blight 等，Science, (2000) 290，1972-1974 页非特许文献3 :Friebe 等，J. Virol.，(2001)75(24) 12047-12057 页非特许文献4 :Ikeda 等，J. Virol.，(2002)76(6) :2997-3006 页非特许文献5 :Kolykhalov 等，Science, (1997) 277，570-574 页非特许文献6 =Kato 等，Gastroenterology, (2003) 125，1808-1817 页非特许文献7 Yanagi 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，(1997)96(16) :8738-8743 页非特许文献8 =Okamoto 等，J. Gen. Virol.，(1991) 73，2697-26704 页非特许文献9 :Aoyagi 等，J. Clin. Microbiol.，(1999)37(6) :1802-1808 页专利技术公开本专利技术的目标是提供含全长HCV基因组序列的RNA的有效复制方法和在细胞培养系统中生产含全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的HCV病毒颗粒的方法。本专利技术的目标迄今为止还从未实现过。为实现以上目标，本专利技术的专利技术人深入研究，结果开发出一种在细胞培养系统中生产HCV病毒颗粒的方法。即，本专利技术如下所述。 一种复制子RNA，其包含的核苷酸序列含有基因型加丙型肝炎病毒基因组RNA 的5'非翻译区、核心蛋白编码序列、El蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B 蛋白编码序列和3'非翻译区，至少一种选择标记基因和/或至少一种报告基因，以及至少一种IES序列。在该复制子RNA中，优选核苷酸序列含在5' -3'方向为以下顺序的5'非翻译区、至少一种选择标记基因和/或至少一种报告基因，和至少一种IRES序列，以及核心蛋白编码序列、El蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A 蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区。在此复制子RNA的更优选实施方案中，基因型加丙型肝炎病毒基因组RNA是含 SEQ ID NO 12所示核苷酸序列的RNA。在此复制子RNA的再更优选实施方案中，5'非翻译区含SEQ IDNO :1所示核苷酸序列，核心蛋白编码序列含SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，El蛋白编码序列含SEQ ID NO 3所示核苷酸序列，E2蛋白编码序列含SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，NS2蛋白编码序列含 SEQID NO 5所示核苷酸序列，NS3蛋白编码序列含SEQ ID NO 6所示核苷酸序列，NS4A蛋白编码序列含SEQ ID NO :7所示核苷酸序列，NS4B蛋白编码序列含SEQ ID NO :8所示核苷酸序列，NS5A蛋白编码序列含SEQ ID NO 9所示核苷酸序列，NS5B蛋白编码序列含SEQID NO :10所示核苷酸序列，而3'非翻译区含SEQ ID NO :11所示核苷酸序列。含以下(a)或(b)RNA的复制子RNA (a)含SEQ ID NO 13所示核苷酸序列的RNA ；或(b)含通过缺失、置换或添加1-100个核苷酸而衍生自SEQ ID NO 13所示核苷酸序列的核苷酸序列、并具有自主复制能力和病毒颗粒生产能力的RNA。 一种生产细胞的方法，其中所述细胞复制复制子RNA并生产病毒颗粒，该方法包括将上述或中任一项的复制子RNA导入到细胞中。用于该方法的细胞优选为增殖性细胞。同样或否则，用于该方法的细胞优选为真核细胞。用于该方法的真核细胞优选为人肝源细胞、人子宫颈源细胞或人胎肾源细胞。所述真核细胞更优选为Huh7细胞、H印G2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞。利用上述的方法可获得的细胞，其复制复制子RNA并生产病毒颗粒。生产丙型肝炎病毒颗粒的方法，包括培养上述W]的细胞，以使该细胞生产病毒颗粒。利用上述的方法可获得的丙型肝炎病毒颗粒。生产丙型肝炎病毒感染细胞的方法，包括培养上述W]的细胞，并用培养物中的病毒颗粒感染其它细胞。通过上述的方法可获得的丙型肝炎病毒感染细胞。筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，包括在测试物质存在下培养选自以下(a)、 (b)和(c)中的至少一种(a)上述的细胞，(b)上述的丙型肝炎病毒感染细胞，和(c)上述W]的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种复制子ＲＮＡ，所述ＲＮＡ含有的核苷酸序列包含基因型２ａ丙型肝炎病毒基因组ＲＮＡ的５′非翻译区、核心蛋白编码序列、Ｅ１蛋白编码序列、Ｅ２蛋白编码序列、ＮＳ２蛋白编码序列、ＮＳ３蛋白编码序列、ＮＳ４Ａ蛋白编码序列、ＮＳ４Ｂ蛋白编码序列、ＮＳ５Ａ蛋白编码序列、ＮＳ５Ｂ蛋白编码序列和３′非翻译区，至少一种选择标记基因和／或至少一种报告基因以及至少一种ＩＲＥＳ序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：胁田隆字，加藤孝宣，伊达朋子，宫本道子，田边纯一，曾根三郎，
申请(专利权)人：财团法人东京都医学研究机构，东丽株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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