一种RNA干扰载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种RNA干扰载体及其应用。本发明专利技术提供了一种RNA干扰载体，包括FAD2基因内含子、位于所述FAD2基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点。所述FAD2基因内含子为序列表中序列1自5’末端第60-1190位核苷酸。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供了一种适用于植物的RNA干扰载体；RNA干扰载体在受体中表达形成的shRNA被Dicer酶剪切成siRNA；siRNA能特异性地抑制靶基因的表达，从而达到控制水稻株高，研究CYP90D2/D2基因功能的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物生物
，特别是一种RNA干扰载体及其应用。
技术介绍
株高是作物育种中的一个重要农艺性状。适当的株高有利于提高作物的生物量， 增强抗倒伏能力，增加产量。在作物株高的常规育种中，通常使用矮源亲本作为供体亲本， 使用株高偏高的优良品种作为受体亲本，先通过杂交将供体亲本的矮源基因导入到受体亲本中，再通过连续回交，在回交后代中选育具有适当株高的优良品系。通过常规育种来改良作物的株高在水稻及小麦等作物中取得了巨大的成功，但是这种方法也存在着一些不足 一是在常规育种中存在连锁累赘现象，即有利基因可能与另外一些不利基因紧密连锁，因此很难用回交的方法将这些不利基因排除掉；二是将供体亲本有利性状导入供体亲本的同时，也将供体亲本的其它一些不良性状导入到受体亲本中，因此要通过数次回交来排除这些不良性状，增加了工作量，延长了育种周期。赤霉素(GilAerellin，GA)和油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)是控制植物株高的两种最主要的植物激素，一些GA和BR突变体表现出不同程度的矮化表型。RNA干扰技术具有高效性、高特异性、重复性好及操作简便等特点，能够弥补上述常规育种的不足，因此可用使用RNA干涉技术来抑制GA或BR合成基因的表达，从而达到改良作物株高，减少育种周期的目的。常用的植物RNA干扰载体除了常规双元载体所必备的核心元件，如启动子，多克隆位点，抗性标记基因外，还包含一段DNA序列作为shRNA(short hairpin RNA，短发夹 RNA)的环状结构。植物RNAi干扰载体一般用细菌的GUS(转β-葡糖醛酸酶)基因片段或植物基因的内含子作为环状结构。与用GUS基因作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体相比，用带剪接位点的基因内含子作为shRNA的环状结构的RNA干扰载体具有更高的干扰效率。在植物转基因载体中，现在常用的外源组成型启动子有来自花椰菜花叶病毒的 35S启动子(CaMV35S promoter)，来自于玉米的W^iquitin(多聚泛素蛋白基因)启动子，及来自水稻的Actin(肌动蛋白基因)启动子。在水稻等单子叶植物中，WDiquitin及Actin 启动子的表达效率要比35S启动子高出几十倍。在将外源片段克隆到载体的分子生物学操作中，同源重组定向克隆和双酶切连接是两种常用的克隆方法。相比后者，前者的优势在于不需要用限制性内切酶酶切目的克隆片段，克服了酶切位点的限制，同时减少了操作步骤，有助于减少工作量，提高工作效率。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种RNA干扰载体。本专利技术提供的RNA干扰载体，包括FAD2基因内含子、位于所述FAD2基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；4所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位。所述上游多克隆位点为Kpn I.Stu I、EcoICRI和&ic I ；所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamHI。所述FAD2基因内含子含有I^st I识别位点，所述I^st I识别位点为序列表中序列 1自5’末端第1185-1190位核苷酸；可与所述下游多克隆位点构成新的下游多克隆位点。所述干扰载体的启动子为WDiquitin启动子。本专利技术的另一个目的提供一种RNA干扰载体。本专利技术提供的RNA干扰载体，按照如下方法制备将DNA片段1与pCUbil390载体骨架共培养，得到的载体；所述DNA片段1包括含有上游多克隆位点的片段a、FAD2基因内含子、含有下游多克隆位点片段的b组成；所述FAD2基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第60-1190位；所述片段a的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-30位；所述片段a上与pCUbil390载体I^st I左侧序列同源的核苷酸为序列1的自5’ 末端第1-18位核苷酸；所述片段b的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1185-1241位，所述片段b上与pCUbil390载体I^st I右侧序列同源的核苷酸为序列表1自5’ 末端第12M-1241位核苷酸。序列1的自5’末端第60-61位的GT和第1189-1190位的AG分别为内含子的剪切位点。序列1的自5’末端第31-59位的核苷酸为FAD2基因部分外显子。所述DNA片段1的核苷酸序列为序列表中序列1 ；所述上游多克隆位点为Kpn I.Stu I、EcoICRI和&ic I ；所述下游多克隆位点为Mlu I、SnaB I和BamH I。所述FAD2基因内含子中含有I^st I识别位点，所述I^st I识别位点为序列表中序列1自5’末端第1185-1190位核苷酸；可与所述下游多克隆位点构成新的下游多克隆位点ο所述pCUbil390载体骨架为将pCUbil390经过I^st I酶切得到的线性载体。本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体。本专利技术提供的重组载体，按照如下I或II方法制备I包括如下步骤1)将DNA片段2插入所述的干扰载体的上游多克隆位点，得到含有所述下游多克隆位点的中间载体A ；2)将DNA片段3插入步骤1)得到的中间载体A的所述下游多克隆位点，得到重组载体；II包括如下步骤A、将DNA片段3插入所述的干扰载体的下游多克隆位点，得到含有所述上游多克隆位点的中间载体B;B、将DNA片段2插入步骤A得到的中间载体B的所述上游多克隆位点，得到重组载体；所述DNA片段2包括目标蛋白编码基因片段和分别位于目标蛋白编码基因两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于目标蛋白编码基因片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述上游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体B同源的核苷酸；所述DNA片段3包括目标蛋白编码基因的反向互补片段和分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子，所述分别位于所述目标蛋白编码基因的反向互补片段两侧的用于插入载体的2种DNA分子均包括所述下游多克隆位点中的至少一种酶切位点、与所述干扰载体或与所述中间载体A同源的核苷酸；所述DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序列3 ；所述DNA片段3的核苷酸序列为序列表中序列4。所述DNA片段2也可以插在干扰载体下游多克隆位点，所述DNA片段3也可以插在干扰载体上游多克隆位点，只要正义片段和反义片段的方向相反即可。上述重组载体的构建中，DNA片段2和DNA片段3中既有同源重组序列又有双酶切位点，即可通过同源重组插入载体的多克隆位点处，得到重组载体；又可以通过双酶切与经过同样酶切得到的载体连接，得到重组载体。所述的干扰载体和/或所述重组载体在植物转基因育种和/或鉴定基因功能中的应用。所述重组载体在植物转基因育种和/或基因功能研究中的应用为抑制目的植物中的靶基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物的株高低于所述目的植物；所述抑制目的植物中的靶基因的表达的方法是通过向所述目的植物中转入重组表达载体实现的。所述靶基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ；所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物优选为水稻；所述株高由节间长度和/或穗长体现。水稻株高=节间长+穗长。本专利技术的实验证明，本专利技术提供了一种适用于植物的RNA干扰载体；本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＲＮＡ干扰载体，包括ＦＡＤ２基因内含子、位于所述ＦＡＤ２基因内含子两侧的上游多克隆位点和下游多克隆位点；所述ＦＡＤ２基因内含子的核苷酸序列为序列表中序列１自５’末端第６０－１１９０位。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：万建民，李辉，程治军，金田蕴，江玲，郭秀萍，王久林，张欣，雷财林，王洁，吴赴清，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：11