本发明专利技术公开了一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，包含一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因simR；所述载体的核苷酸序列为SEQ?ID?NO.4所示序列。其中simR基因是一种辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的启动子和hmg基因组成。本发明专利技术还公开了所述表达载体在超嗜热泉古菌中表达超嗜热酶的应用。本发明专利技术的载体具有广泛的宿主范围，转化效率高，假阳性低，可以简便、快速、高效的表达带有组氨酸标签的超嗜热酶，预示本发明专利技术的载体具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种古菌表达载体及其应用，尤其涉及一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体及其应用，属于生物
技术介绍
根据16S rDNA序列，生物界分为真细菌(Eubacteria)，真核生物(Eucarya)和古细菌(Archaebacteria)三个域。目前，古菌分为四个界泉古菌(Crenarchaeota)，广古菌 (Euryarchaeota),初生古菌(Korarchaeota)禾口纳米古菌(Nanoarchaeota)。泉古菌中又有一类超嗜热泉古菌，它们的最适生长温度为70-85°C，最适生长pH值为2-3。超嗜热泉古菌自身合成的蛋白酶、脂肪酶、DNA聚合酶能耐酸、耐高温，它们中的一些酶已成功的应用于工业生产。超嗜热酶在大肠杆菌中异源表达后，其酶活和性质有的发生改变，有的酶基因在大肠杆菌中不表达，或者异源表达后形成包涵体，因而为了更好的研究和利用超嗜热酶， 在古菌自身体系中表达超嗜热酶非常必要。目前存在的超嗜热泉古菌表达体系主要利用 PyrEF基因为选择标记基因，要求宿主必须为尿嘧啶为营养缺陷性菌株，另外这个体系得到的转化子假阳性较高，且相应的选择培养基价格比较昂贵。以抗生素标记作为选择基因，可以克服上述缺陷。然而，在相关的检索中，目前还未见有此类报道。
技术实现思路
针对现有技术，本专利技术的目的是提供一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体及其应用。本专利技术所述的基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，是一种环状穿梭载体， 其特征在于其包括一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因SimR ；所述载体命名为pSSR ；载体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示序列。其中上述选择标记基因SimR是一种辛伐他汀抗性基因，由Sac7d基因的启动子和hmg基因组成；其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示序列。本专利技术所述的基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体的构建方法，步骤是1)设计合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sadd 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘hmg 上游5 ‘ CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5 ‘ TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘2)以 Sulfolobus acidocaldarius 基因组 DNA 为模板，用 sac7d 上游和 sac7d 下游引物进行PCR扩增，得到Sac7d基因的启动子片段；3)以Sulfolobus tokodaii基因组DNA为模板，用hmg上游和hmg下游引物进行PCR扩增，得到hmg基因片段；4)利用重叠延伸PCR将sac7d基因的启动子和hmg基因融合，得到simR基因；5)用Mel和XmaI限制性内切酶双酶切simR基因和pZC载体；6)用T4DNA连接酶对酶切后的simR基因和pZC载体进行连接；7)以步骤6)的含重组载体的连接液转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，提取质粒，获得基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，即PSSR载体。本专利技术所述表达载体在超嗜热泉古菌中表达超嗜热酶的应用。其中上述超嗜热酶优选是半乳糖苷酶或DNA解旋酶。上述超嗜热泉古菌优选冰岛硫化叶菌。本专利技术构建了基于抗生素一辛伐他汀(simvastatin)标记的超嗜热泉古菌表达载体。辛伐他汀作为一种抗生素，其原理是作为3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，辛伐他汀阻碍了 HMG-CoA生成甲羟戊酸，进而阻碍了细胞膜脂的合成，因此，只要在细胞内过量表达HMG-CoA还原酶就能解除辛伐他汀对细胞生长的抑制。本专利技术的载体以抗生素抗性为选择标记，相对于营养缺陷性标记的载体，该载体具有更广泛的宿主范围，既可以是营养缺陷性菌株，也可以是野生型菌株。实验证实本专利技术的载体转化冰岛硫化叶菌的效率较高，假阳性较低，可以简便、快速、高效的表达超嗜热酶。表达的超嗜热酶既可在氨基端，也可在羧基端加入组氨酸标签，大大方便了蛋白的纯化，并且经过一步镍柱亲和层析即可得到纯度较高的目的蛋白。预示本专利技术的表达载体在超嗜热酶的表达方面有很大的应用前景与经济价值。附图说明图1为pSSR载体图谱。图2为转化了 pSSR-lacS载体的冰岛硫化叶菌X_gal显色结果。图3为在冰岛硫化叶菌中表达的HerA蛋白SDS-PAGE结果，其中M是蛋白marker， 1是菌体破壁后的全蛋白，2是经镍柱亲和层析后的蛋白。具体实施例方式实施例1、辛伐他汀抗性基因simR的获得1)获得sac7d启动子DNA片段设计引物sac7d上游和Sac7d下游，引物Sac7d上游中加入了 ^icI酶切位点，引物sac7d上游和sac7d下游的序列如下sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3 ‘sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3 ‘以 Sulfolobus acidocaldarius 基因组 DNA (GenBank :CP000077)为模板，用引物 sac7d上游和sac7d下游PCR扩增sac7d启动子DNA片段。PCR 反应体系10XPCRbuffer 5yL，上游、下游引物(ΙΟμΜ)各 lyL，模板 lyL， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。得到纯的sac7d启动子DNA片段，其DNA序列是如SEQ ID NO. 1所示序列。幻获得hmg基因片段设计引物hmg上游和hmg下游，引物hmg下游中加入了 XmaI酶切位点，引物hmg 上游和hmg下游的序列如下hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3 ‘hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3 ‘以 Sulfolobus tokodaii 基因组 DNA(GenBank :BA000023)为模板，用引物 hmg 上游和hmg下游PCR扩增hmg基因片段。PCR反应体系10 XPCR buffer 5 μ L，上游、下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L，模板 1 μ L， dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L，pfu 酶(2. 5U/ μ L) 1 μ L,最后补水至 50 μ L。反应条件94°C热变性5min ；94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸aiiin，共30个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物在0. 5 X TBE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(omega公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物_20°C保存备用。得到纯的hmg基因片段，本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，其特征在于：所述表达载体包括一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因ｓｉｍＲ；所述载体命名为ｐＳＳＲ；载体的核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤＮＯ．４所示序列。
【技术特征摘要】
1.一种基于抗生素标记的超嗜热泉古菌表达载体，其特征在于所述表达载体包括一个原核复制起点、一个古菌复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点、阿拉伯糖启动子和抗生素选择标记基因SimR ；所述载体命名为PSSR ；载体的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4所示序列。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述选择标记基因SimR是一种辛伐他汀抗性基因，由sac7d基因的启动子和hmg基因组成；其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示序列。3.根据权利要求1所述载体的构建方法，步骤是1)设计合成如下引物sac7d 上游5' TAATTGAGCTCCCCTCACTATAACT 3' sac7d 下游5' TCTCTTGCATATTAGGTCAAGTTATCT 3' hmg 上游5' CTTGACCTAATATGCAAGAGATAATTG 3' hmg 下游5' TATATACCCGGGATGGTTAAGTTAATT 3'2)以Sulf...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪金凤，申玉龙，郑涛，佘群新，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88
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