本发明专利技术涉及一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体及其构建方法和应用。所述的植物RNA干扰载体是：将序列表SEQIDNO.1所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列（作为正向核酸片段）和序列表SEQIDNO.2所示的紫花苜蓿CCoAOMT部分核酸序列（作为反向核酸片段）插入植物表达载体pFGC5941中，构建成植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。用获得的干扰载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，获得了含干扰载体的农杆菌工程菌。利用含干扰载体的农杆菌工程菌转化植物，培育低木质素含量植物，利用该方法，获得了生长正常、木质素含量降低的转基因植物，为培育低木质素牧草、造纸植物等提供种质资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种抑制木质素合成的植物干扰载体的构建及其在培育低木质素含量植物中的应用。
技术介绍
木质素是植物体内一类重要的大分子酚类聚合物，其数量巨大，在自然界中的含量仅次于纤维素，居有机多聚物的第二位，通常占植物体干重的10%左右，在树木甚至可以达到30%。木质素在陆生植物的生长发育中起着及其重要的作用。然而，牧草中木质素过量的沉积却影响牲畜对牧草 中营养成分的吸收；工业用植物中的木质素也加大了利用植物纤维的成本。因此，在畜牧生产和植物纤维利用工业中一直希望获得木质素含量低的新植物品系，从而改善牧草的营养特性或是降低工业生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，该干扰载体含有部分紫花苜蓿(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)基因序列。CCoAOMT是木质素合成关键酶之一，编码CCoAOMT的基因为CCoAOMT基因。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中应用，为培育低木质素含量牧草等提供良好素材。本专利技术的另一个目的是提供一种将构建的干扰载体转入植物细胞的方法，利用该方法，将该干扰载体转入植物细胞，经培养获得生长正常的低木质素含量植株。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施:一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，所述的植物RNA干扰载体是:将序列表SEQ ID N0.1所示的核酸序列作为正向核酸片段和序列表SEQ ID N0.2所示的核酸序列作为反向核酸片段插入植物表达载体PFGC5941中。序列表所示的核酸序列为插入了酶切位点的紫花苜蓿片段。上述的抑制木质素合成的植物RNA干扰载体的构建方法，包括以下步骤: 1)紫花苜蓿总RNA的提取 2)反转录获得紫花苜蓿cDNA； 3)带有相应酶切位点的，分别作为正向核酸片段和反向核酸片段的紫花苜蓿CCoAOMT核酸序列的PCR扩增； 4)PCR扩增的正向核酸片段和反向核酸片段经过切胶回收，分别连接到T载体上； 5)双酶切连接到T载体上的正向核酸片段和植物表达载体pFGC5941，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得中间载体pFGC5941-CCoAOMT I ； 6)双酶切连接到T载体上的反向核酸片段和pFGC5941-CCoA0MTl，电泳回收目的片段，T4连接酶连接，获得植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi。将植物RNA干扰载体——pFGC5941-CCoAOMTi质粒转入根癌农杆菌中，获得重组根癌农杆菌。上述的植物RNA干扰载体在培育低木质素含量植物中的应用，其方法如下: I)转导过程采用叶盘法 取植物(如烟草或其它植物)健壮叶片，剪成0.5 cm 2左右的叶盘，在分化培养基中预培养2d后，放入上述的含有植物RNA干扰载体pFGC5941-CCoAOMTi的重组根癌农杆菌中浸泡lOmin，取出后接种到分化培养基中，暗培养2d。转入筛选分化培养基，进行卡那霉素抗性筛选及不定芽的诱导。将诱导的不定芽从基部切下，转至生根培养基中生根。当根系发育完全，根长1.5 2.0cm时，移栽再生苗，获得转基因植株。2)转基因植株的PCR检测 提取转基因材料基因组DNA，以基因组DNA为模板，35S启动子加序列表SEQ ID N0.1所示的正向基因片段为检测目标，进行PCR反应；PCR产物测序、比对。通过该方法筛选阳性转基因植株。上游引物:5’一 GCACGACACTCTGGTCTACTC—3， 下游引物:5’ — TTAITTAATGGGCTAAAAATGGTT— 3’。3)生长正常的低木质素含量植株的获得 转基因植株木质素含量的测定:通过经典的Klason法测定样本木质素的含量。筛选木质素含量较野生型降低10%以上的材料继续培养。转基因植株生理生化指标的测定:筛选木质素含量较野生型降低10%以上的转基因植株继续培养，以外观、株高、单株重为指标，比较转基因与野生型材料在生长势方面的差异，以生长势与野生型无显著差异的转基因植株为最终获得的生长正常的低木质素含量植株。本专利技术的有益效果是:本专利技术采用来源于紫花苜蓿(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶)的部分基因序列，构建了一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，采用农杆菌介导法将该干扰载体转入植物细胞，经培养获得生长正常的低木质素含量植物，为培育低木质素含量的牧草、造纸材料等提供种质资源。附图说明图1是双酶切验证干扰载体正向核酸片段； Ml =Marker (2000bp) ；M2 =Marker (15000bp) ;1 6 ;重组载体酶切产物。图2是双酶切验证干扰载体反向核酸片段； Ml =Marker (15000bp) ；M2 =Marker (2000bp) ;1 3 ;重组载体酶切产物。图3是转化植株(烟草)的PCR检测(2000bp Marker)； M =Marker (2000bp) ;1 5 ;有目标片段，为阳性植株；6:无目标片段，为野生型植株；7:重组质粒:8:水。具体实施方式 实施例1:紫花苜蓿CTo撕基因片段的克隆1.紫花苜蓿总RNA的提取 (1)取幼嫩的紫花苜猜组织IOOmg,加入液氮研磨；向研钵中加入ImLRNAiso Plus,室温静置至样品完全融化，继续研磨至裂解液呈透明状； (2)将匀浆转移至离心管中；12000r/min，4°C，离心5min;取上清移入新的离心管中； (3)向上清液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量)，震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min ； (4)12000 r/min，4°C，离心15min ;吸取上清液转移至另一新的离心管中； (5)向上清中加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置IOmin； (6)12000 r/min,4°C,离心 IOmin ;弃上清，缓慢加入 75% 的乙醇 ImL ； 12000 r/min,4°C，离心5min后弃乙醇； (7)室温干燥沉淀2 5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存，得RNA模板。2.经过反转录获得紫花苜蓿cDNA (I)紫花苜蓿cDNA第一链的合成。将获得的RNA模板(3 μ I)、Primer Mix (2 μ I)、dNTP Mix (4 μ I)和 RNase-Free Water (4 μ I)配置反应体系，70°C孵育 lOmin，迅速冰浴2min。短暂离心。继续向以上反应液中加入5XRT Buff (4μ 1),0.1M DTT (2μ I), 42°C孵育 2min;加入 Ιμ HiF1-MMLV (200U/μ I )，42°C孵育 50min。70°C 孵育 15min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。(2)紫花苜蓿cDNA合成。上述反应产物作为模板，进行PCR反应，获得紫花苜蓿cDNA序列。3.带有相应酶切位点的紫花苜蓿基因部分片段的扩增 以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增CCoAOMT基因片段。扩增正向核酸片段，上游引物5’ -GGCGCGCCACGGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制木质素合成的植物RNA干扰载体，其特征在于所述的植物RNA干扰载体是：将序列表SEQ?ID?NO.1所示的紫花苜蓿CCoAOMT?部分核酸序列作为正向核酸片段和序列表SEQ?ID?NO.2所示的紫花苜蓿CCoAOM?部分核酸序列作为反向核酸片段，插入植物表达载体pFGC5941中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩阳，王红艳，段亚楠，卢福荣，茹艺，李曹娜，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：
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