本发明专利技术“干扰Bx-cpl-1基因表达的dsRNA载体及其在松材线虫防治和研究中的应用”，属于植物病虫防治技术。所述dsRNA干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Bx-cpl-1基因的完整或部分正义链和与所述正义链互补的反义链。可用于松材线虫的防治和研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病虫防治
，特别是涉及一种干扰Βχ-cpl-l基因表达的 dsRNA载体及在松材线虫防治和研究中的应用。
技术介绍
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilu)是一种对森林具有极大危害的寄生线虫，它主要危害松属树种为代表的针叶树木。二十世纪，日本的松树感染上松材线虫后，遭到了毁灭性的破坏。在我国，松材线虫病于1982年在南京首次被发现。之后，疫情迅速蔓延，对我国的松林资源照成了极大的破坏，其经济损失难以估量，松材线虫病甚至已经直接对我国的张家界等世界自然文化遗产景观造成了威胁。松材线虫病素有“松树的癌症”之称，因为其蔓延异常迅速，一旦发病，树木会很快死亡，因而防治难度非常之大。由于该病疫的传播和人类的活动有密切的关系，因此不少国家将其列为A类植物检疫对象。为了避免松材线虫病对我国的森林资源照成危害，对于松材线虫病的防治迫在眉睫。松材线虫病的传播异常迅速，一旦疫情发生就难以控制。该病到目前为止仍然没有得到有效的控制。因此，要始终坚持以预防为主的政策，对于已经受灾的地区要严格控制松材线虫的蔓延。目前，主要可以通过两种方法治疗松材线虫病。由于松材线虫在树干内部，因此可以将杀虫剂注射到树干或浇灌到根部，另一种是用飞机喷撒化学药剂来防治天牛。这两种方法有一定疗效，但是其性价比较低。对于树干注射治疗，其成本高，因此不适合大面积推广；而用飞机喷撒化学药剂来防治天牛，成本也比较昂贵，并且具有一定负面效应。由于化学防治具有较多缺陷，因此人们开始更多地关注松材线虫的生物防治。研究显示许多真菌对线虫的生存有抑制作用，如总状共头霉和日本亮耳菌等，但是由于松材线虫的繁殖速度惊人，生物防治的作用远远赶不上其扩散速度。因此，已有的防治措施都无法有效防治松材线虫。我们只能寄希望于致病机理研究上的突破。目前，最经济有效的途径是利用分子生物学技术，对松树的抗性基因进行筛选，然后再通过转基因技术使松树获得对松材线虫的抗性。半胱氨酸蛋白酶的活性位点含有半胱氨酸残基。该酶广泛存在于自然界的各种生物当中，例如细菌、真菌、植物、哺乳动物和人类等。因此，关于该酶的研究比较多。研究表明，半胱氨酸蛋白酶在线虫入侵组织或细胞、提供胚胎发育所需的营养成分、蜕皮、消化宿主蛋白、调节免疫反应以及逃避宿主免疫反应的清除等过程中发挥着至关重要的作用。半胱氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶的一类。该酶在生物体内最开始合成时为一种前体物质，该物质包括两个区前体区和催化区。半胱氨酸蛋白酶家族中有高度保守的典型的三联体催化活性中心Cys-His-Asn。线虫半胱氨酸蛋白酶为线虫的主要“消化酶”，通常表达在线虫的食道腺和肠细胞中，发挥着蛋白水解活性。线虫摄取食物、入侵宿主细胞以及免疫等方面的功能均与半胱氨酸蛋白酶有密切关系，因此，近年来对该酶的研究愈加广泛深入。研究发现，半胱氨酸蛋白酶存在于多种线虫体内，不同的线虫，分泌这种酶的部位不同，而且酶的分布部位也有所差异。有些线虫的卵母细胞中包含L型半胱氨酸蛋白酶，如秀丽隐杆线虫；在很多线虫的不同发育期，虫体肠腔内中都发现了 B型和L型半胱氨酸蛋白酶，如捻转血矛线虫(Haemonchus controtus)和南方根结线虫(Meloidyne incognita)。吕春花(吕春花.相似穿孔线虫S型半胱氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析. 植物保护，2008，34 (5) :17-22.)等从松材线虫中分离到半胱氨酸蛋白酶家族的两个基因 (Bx-cpl-U Bx-cpl-2)并在大肠杆菌中初步表达，但并未揭示并证明这两个基因在线虫生活史中的功能。RNA干扰(RNAi)，是指由双链RNA引发的转录后基因沉默的机制。随着技术的发展，RNA干扰技术越来越受研究人员的关注。目前，RNA干扰技术已经广泛应用于线虫基因分析。R)rd等通过RNA干扰分析组织蛋白类半胱氨酸蛋白酶基因在马来丝虫成虫中的作用。用丝虫CPL基因家族的Bm-cpl-1和Bm-cpl_5处理马来丝虫雌雄成虫，或者用Bm-cpz-1 dsRNA处理，均导致了微丝蚴数量下降。通过Bm-cpl-5或Bm_cpl的dsRNA和siRNA处理雌虫子宫，结果显示胚胎发育受到明显影响，导致晶胚畸形和不同的胚胎阶段。通过对秀丽杆线虫L型组织蛋白酶(Ce-cpl-Ι)和Z型组织蛋白酶(Ce-cpz-Ι)进行功能分析，确定了控制它们的两种基因在早期的胚胎发育中都是必要的，Ce-cpl-Ι在卵黄蛋白分解期间起调控作用，Ce-cpz-Ι在蜕皮中起重要作用。对于RNA干扰的介导，目前，细菌介导的RNAi技术在模式线虫基因功能的研究中起到了重要的作用，成为模式线虫基因功能研究的主要方法。目前RNAi的手段也成为松材线虫基因功能的一种重要方法，但是目前所采用的都是浸泡法，体外转录合成dsRNA浸泡松材线虫来分析基因的功能，该方法存在着极大地不足，主要表现在不能持续干扰，而且极其不稳定，如何实现RNA的稳定干扰也是本专利技术进一步需要实现的目的。
技术实现思路
本专利技术根据上述领域存在的空白和松材线虫防治的需要，提供干扰Βχ-cpl-l基因表达的dsRNA载体及在松材线虫防治和研究中的应用。干扰松材线虫Βχ-cpl-l基因表达的dsRNA干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Βχ-cpl-l基因的完整或部分正义链和与所述正义链互补的反义链。所述骨架载体为农杆菌介导的表达载体。所述正义链的核苷酸序列如kq ID No. 2所示，所述正义链的核苷酸序列如所示 Seq IDNo. 3所示，所述农杆菌介导的载体为PHDT-RH，所述正义链插入在PHDT-RH的LB和 RB之间的5，端多克隆位点，所述反义链插入在PHDT-RH的LB和RB之间的3，端多克隆位点，得到的dsRNA干扰载体为PHD-RH-CPL1。转入有上述dsRNA干扰载体的菌株。所说菌株指丝状真菌。所述真菌指转入有PHD-RH-CPL1的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。上述dsRNA干扰载体在松材线虫防治中的应用。一种研究Βχ-cpl-l基因功能的新方法，其特征在于，将上述dsRNA干扰载体转化到丝状真菌中，然后通过丝状真菌转化子的菌丝体饲喂松材线虫，观察松材线虫的表型。所述丝状真菌指灰葡萄孢菌。本专利技术的专利技术人对前人获得的半胱氨酸蛋白酶基因Βχ-cpl-l在线虫生活史中的作用进行研究，采用该基因的部分片段构建成RNA干扰载体，并通过农杆菌介导转入灰葡萄孢菌中，该转基因灰霉菌丝饲养松材线虫对松材线虫的CPL进行干扰试验，采用荧光定量PCR检测被干扰的松材线虫的半胱氨酸蛋白酶基因Βχ-cpl-l的转录后表达量，结果显示，随着干扰时间的增加，半胱氨酸蛋白酶基因的转录水平逐渐降低，与对照相比，感染效果具有显著差异。半胱氨酸蛋白酶的活性测定显示，Βχ-cpl-l基因的表达连续被干扰10代的松材线虫，其半胱氨酸蛋白酶的活性降低20.9%，其5天内的繁殖量降低40%，线虫体长也有明显缩短。这些实验数据说明，Βχ-cpl-l基因的表达在松材线虫的胚胎发育过程中起着关键作用，因而干扰该基因的表达可以达到生物防治松材线虫的目的。基于这些实验结果，本专利技术提供一种干扰松材线虫Βχ-cpl-l基因表达的ds本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．干扰松材线虫Ｂｘ－ｃｐｌ－１基因表达的ｄｓＲＮＡ干扰载体，其特征在于，在骨架载体的多克隆位点上按顺序正向插入有Ｂｘ－ｃｐｌ－１基因的完整或部分正义链和与所述正义链互补的反义链。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王殿东，白婷，陈国华，成新跃，许鸥，谢丙炎，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：11
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