本发明专利技术公开了一种提高动物繁殖力的干扰载体，其序列包含基因序列Sequnence?NO.11。本发明专利技术针对绵羊干扰素INHA基因的核苷酸序列设计合成多对miRNA单链寡核苷酸，构建了pMD-18T载体，通过功能性实验筛选，得到了抑制效果较强的MR062-3-R(Sequnence?NO.6)载体，该载体包含基因序列Sequnence?NO.11，进一步将基因序列Sequnence?NO.11构建到miRNA慢病毒干扰载体。本发明专利技术还公开了上述新型载体的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型载体的构建。具体而言，本专利技术针对绵羊干扰素INHA基因的核苷酸序列设计合成miRNA单链寡核苷酸，构建了 miRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。
技术介绍
人类首次从牛的睾丸组织中分离、纯化到了一种糖蛋白激素，根据其具有特异性地抑制垂体细胞分泌及合成促卵泡素O^ollicle-Stimulating Hormone, FSH)的生物学活性而将它命名为抑制素anhibin，INH)，以后逐渐发现它在多个组织器官中广泛分布。抑制素分子由一个α亚基与一个β亚基通过二硫键连接而成。生物体中只有当α亚基与 β亚基处于结合状态时，抑制素表现出生物活性。在生理状况下抑制素能选择性地抑制垂体合成和分泌促卵泡素，从而影响卵巢上卵泡的发育和成熟，是调节家畜繁殖力的重要生殖激素之一。研究表明抑制素α亚基与动物繁殖性能之间存在密切的关系。采用PCR-SSCP 技术检测抑制素a (inhibina , INHA)基因5'调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种 (小尾寒羊)以及低繁殖力绵羊品种(中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性，结果发现小尾寒羊、中国美利奴绵羊和考力代绵羊在INHA基因5'调控区发生了 1处碱基突变(316C —T)，南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变；小尾寒羊和考力代绵羊在INHA基因外显子1中发生了 1处碱基突变(877T —C)，中国美利奴绵羊和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变； 初步表明INHA基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记。对高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间抑制素α亚基基因多态性的研究发现，高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间基因型分布差异都极显著(P <0.01)。田秀娥等用 PCR-SSCP方法检测和分析3个绵羊品种(滩羊、蒙古羊和小尾寒羊)INHA基因的多态性， 研究不同基因型对产羔数的影响，发现滩羊、蒙古羊和小尾寒羊Pl (5’调控区282核苷酸处发生的1处A — G突变)位点C、D基因频率分别为0. 840和0. 160,0. 852和0. 148及 0. 162和0. 838，均处于中度多态；P2位点E、F基因频率分别为0. 784和0. 216,0. 787和 0. 213及1. 000和0. 000，滩羊和蒙古羊在该位点均处于中度多态；引物P3扩增片段中，滩羊和蒙古羊表现为A、B和C三种单倍体基因型，而小尾寒羊仅表现出A和B2种基因型。 鉴于 INHA 对绵羊繁殖力的影响，Li Han 等将抑制素 α亚基(1-32)片段插入到HBsAg-S的羧基端，构建出一种抑制素DNA疫苗。用这种疫苗免疫40只绵羊，结果发现经过绵羊的实验组绵羊的双胎率(39.2%)显著高于对照组绵羊的双胎率(10% ) (P < 0. 05)。结果表明用针对抑制素构建的DNA疫苗进行免疫可诱导产生更多的卵泡，从而增加产仔数。此外许多研究也表明通过抑制素主动免疫，使动物产生抑制素抗体，解除内源性抑制素对垂体FSH合成和释放的抑制作用可以提高动物的繁殖力 。Lee等首先在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，时隔七年之后，Reinhart等又在同类线虫中发现第二个异时性开关基因let-7。由于这类基因所编码的能时序调控发育进程、长度约为21个核苷酸的小分子RNA的长度很短而且作用时间也是暂时的，所以开始被命名为stRNA(Small Temporal RNA)。随后多个研究小组分别从线虫、果蝇和人体等多种真核生物细胞中发现了近千个相似的小分子RNA，统称为miRNA。miRNA长21_25nt，由70_90nt的可形成发夹结构的内源性转录前体pri-miRNA加工而成，在进化上具有高度的保守性。miRNA能够通过与靶 mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演重要的角色。研究表明体外构建针对特定基因的miRNA表达载体可有效抑制相应靶基因的表达 。而t曼病毒以其较低的转染条件(可转染分裂和非分裂细胞)和较高的转染效率被广泛应用于基因表达的研究中。曾东风等针对在人肿瘤及肿瘤基质形成过程中发挥重要作用的转录因子 HIF-I α构建了 miR RNAi慢病毒载体，经测序验证后正式microRNA慢病毒干扰载体构建成功，为进一步探索白血病的治疗创造了新切入点。张红梅等构建了针对基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的miRNA慢病毒干扰载体，并研究了其对小鼠肝脏星状细胞HSC-T6中 TIMPl表达的影响，结果表明构建的慢病毒载体可有效抑制靶基因TIMPl的表达。抑制素主动免疫这种方法只对亲代动物起作用，其不可能建立一种长效机制，将亲代高繁性状传递给子代动物。为了解决这一问题，本专利技术从microRNA入手，构建了针对绵羊抑制素α亚基的miRNA慢病毒干扰载体，转入绵羊基因组，抑制绵羊体内抑制素的表达水平，从而可使子代动物获得与亲本相同的繁殖力，为高繁殖力绵羊新品种培育奠定基石出。
技术实现思路
本专利技术公布了一种提高动物繁殖力的干扰载体，所述miRNA慢病毒干扰载体包含基因序列 kqunence Ν0· 11。所述载体可以抑制绵羊抑制素的蛋白表达。由于所述载体在细胞内表达包含基因序列kqunence NO. 11的miRNA，干扰了绵羊抑制素的mRNA水平，使其翻译受限从而抑制了绵羊抑制素的蛋白表达。将所述miRNA慢病毒干扰表达载体与脂质体和台酚蓝混合，制备成转染液。接着采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入绵羊两侧的睾丸中再与雌性交配，得到10只阳性的雌性Fl代。进一步将阳性的雌性Fl代进行繁育实验，与非转基因绵羊相比其双胎率得到了显著的提高。所述载体可以应用于培育高繁殖力绵羊新品种。由于所述载体抑制了绵羊抑制素蛋白的表达，减轻内源性抑制素对垂体FSH合成和释放的抑制作用可以提高动物的繁殖力，为高繁殖力绵羊新品种培育奠定基础。本专利技术还公开了一种PMD-18T载体，所述PMD-18T载体包含基因序列kqunence NO. 6。附图说明图1MR062-1号干扰质粒与INHA高表达质粒共转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野；B 可见光视野)。图2MR062-2号干扰质粒与INHA高表达质粒共转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野；B 可见光视野)。图3MR062-3号干扰质粒与INHA高表达质粒共转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野B 可见光视野)。图4MR062-4号干扰质粒与INHA高表达质粒共转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野；B 可见光视野)。图5SR-neg阴性对照质粒与INHA高表达质粒共转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野；B 可见光视野)。图6空白对照质粒转染HEK293细胞QOO X) (A 荧光视野；B 可见光视野)。图7干扰质粒对INHA基因的沉默效率。图8MR062-3号慢病毒干扰质粒病毒包装后4 细胞情况QOO X) (A 荧光视野； B 可见光视野)。图9病毒浓缩液稀释本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苗向阳，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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