本发明专利技术公开了检测无形体及立克次体等5种病原体实时荧光定量PCR试剂盒及其方法。本发明专利技术依据无形体及立克次体等5种病原体特异基因核苷酸序列设计了特异寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术提供了检测无形体及立克次体的方法和以特异性引物所组成的高灵敏性检测试剂盒。所述试剂盒操作简便、快速，灵敏度高且特异性强。采用本发明专利技术的试剂盒可对5种相关立克次体进行快速特异性检测并且适于在临床实验室及疾病监测组织实验室使用。本发明专利技术还公开了利用试剂盒检测无形体及立克次体的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及无形体及立克次体等5种病原体的检测试剂盒及方法。具体而言，本专利技术涉及以无形体及立克次体等5种病原体特异基因高度保守核苷酸序列为基础，设计特异性的寡核苷酸引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术组装无形体及立克次体检测试剂盒，本专利技术也涉及其检测方法。
技术介绍
无形体、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、斑疹伤寒、贝氏柯克斯体均属于立克次体目致病成员。无形体病是严重威胁人、畜健康的新发蜱传自然疫源性立克次体病，由嗜吞噬粒细胞无形体感染引起。目前美国CDC已经将该病列为法定报告传染病。人类感染主要通过硬蜱的叮咬而传播。2006年，我国安徽省某医院却发生了人-人传播的院内感染事件。大量的病原学、分子生物学及血清学调查数据证实上述疾病普遍存在我国及周边国家。2006年， 我国天津地区农业人群血清抗体流行率8. 8%，连续动态监测结果显示，该病人群血清流行率明显增加。全国农业人群调查结果显示，平均阳性率为13.9%。该病病死率为1_5%。作为新发传染病，该病还没有得到足够认识。恙虫病(tsutsugamushi disease, scrub typhus)是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, Ot)引起的自然疫源性疾病，主要分布于热带、亚热带的亚太平洋地区，在我国广泛分布。以鼠类为主要传染源，经恙螨幼虫叮咬而传给人。临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征。恙虫病又名丛林热斑疹伤寒，在我国有悠久的历史。早在晋朝的《肘后方》和《抱朴子》中记载一种名沙虱的小虫能致沙虱毒，并详细记载了该病的流行病学、症候学、预防和治疗等。明朝李时珍在《本草纲目》中记述闽粤有一种恶生流行热症，系由沙虱传染，其症状有溃疡、发热和疹子，此种记载与今日恙虫病的特征相符。1948年广东报告了恙虫病的第一例病例。1985年以前，我国恙虫病仅在北纬31° 以南的广大地区流行，即南方疫源地，流行范围东至台湾、福建，西至云南、四川和西藏南部，南至海南、广东和广西，北至浙江和湖南、江西诸省区均有流行。1986年以来，我国恙虫病疫源地北移的现象已被许多学者的调查研究所证实。目前，除个别省份没有报道外，全国均有散发或局部流行爆发。斑点热群立克次体(STOR)属于立克次体属，是一种专性细胞内寄生的革兰阴性菌，在世界范围内广泛分布。该病原体可通过蜱、螨及蚤进行垂直或水平传播，并在脊椎动物和节肢动物中循环，这些动物对SreR在自然界中的持久循环起着重要作用。然而，近年来通过血清学和分子流行病学调查发现在家畜和宠物中立克次体病的感染率很高，说明人的患病风险也不断增加。斑疹伤寒是严重威胁人类健康最古老的立克次体病。当前，世界反生物恐怖已将流行性斑疹伤寒病原体列为生物战剂名录。斑疹伤寒分为流行性斑疹伤寒及地方性斑疹伤寒两种，前者主要通过体虱传播-既人-体虱-人；而后者主要通过鼠蚤传播-既鼠-鼠蚤-人。两者引起的临床表现相似，但流行性斑疹伤寒表现较为严重，主要表现高热、头痛、 斑疹、肌肉痛、肝酶升高，严重患者可发生多脏器衰竭甚至死亡，该病病死率可高达15%。斑疹伤寒目前在发达国家已经得到控制，但在发展中国家如非洲、亚洲等地区仍广泛流行，同发达国家一样，我国流行性斑疹伤寒基本得到控制，然而，地方性斑疹伤寒仍在广大农村地区流行。最新流行病学调查结果显示，我国云南地区地方性斑疹伤寒病原体-莫氏立克次体在当地农业人群中血清IgG抗体阳性率为16. 46%。当地主要家畜包括牛、羊及狗等IgG 抗体总阳性率高达61. 48%。贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii, Cb)俗称Q热立克次体，为Q热的病原体，可引起人类急、慢性Q热⑴fever)。该病原体严格寄生于活细胞内，对理化因子抵抗力极强， 人类和动物普遍易感，可通过气溶胶广泛传播，因此美国反恐怖组织将其列为生物战剂。目前Q热已成为世界上分布最广的人兽共患病之一。感染的家畜牛、羊为主要传染源，猫、狗等宠物和啮齿动物鼠及节肢动物蜱、螨等均可传播本病。无形体、恙虫病东方体、斑点热群立克次体、斑疹伤寒、贝氏柯克斯体的检测方法需要进一步改进。间接免疫荧光(IFA)是诊断无形体及立克次体疾病的金标准。然而，该方法依赖于患者急期及恢复期体内特异性的抗体的检出，并不能作为疾病早期快速诊断的方法。分离培养技术是一种可靠的方法，但需要较长时间才能获得阳性结果并且只能在P3实验室中进行，这些因素限制了其用途。由于对该类疾病的认识不足及缺乏必要的实验室诊断技术，因此，临床容易误诊及漏诊，往往导致病人多器官受累死亡。目前，我国临床对该类疾病的诊断还主要依赖临床表现及经验治疗，少数较好的单位仍然使用特异性较差的传统外斐氏反应。国外许多专业实验室已经发展了各种PCR技术，替代分离率较低的病原分离技术。随着荧光定量PCR技术的发展，本研究室以无形体msp2特异基因、恙虫病东方体56KD蛋白基因、斑点热群立克次体ompA基因、斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白groEL基因、贝氏柯克斯体ISlllla基因等保守序列设计MGB探针，建立了敏感、特异、快速的定量PCR技术。
技术实现思路
本专利技术公开了检测无形体及立克次体等5种病原体的实时荧光定量PCR试剂盒及其方法。本专利技术首先公开了一种检测无形体的实时荧光定量PCR试剂盒。本专利技术的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本专利技术的试剂盒可采用以下方法实施根据GenBank提供的无形体msp2基因序列(EF143798)进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针可检测39株不同分离株。采用ABI primer Express 2. 0软件设计探针和引物。设计引物MF、MR和探针MP，其中引物MF的序列见Sequence NO. 1，引物MR 的序列见kquence NO. 2，该对引物扩增产物为159bp。特异性探针MP的序列见kquence NO. 3，或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的互补序列；或者使用上述序列中任意一种或一种以上的组合。采用25 μ 1反应体积，每个反应中含12. 5 μ 1通用PCR反应混合物 ；800nM 各引物；400nM 探针；2 μ IDNA 模板；补无菌水至 25 μ 1。反应条件为95°C IOmin后，以95°C 40s和60°C Imin循环45次。本专利技术公开了一种检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR试剂盒。本专利技术的试剂盒包括特异性引物、特异性探针、标准DNA模板以及其他常规荧光定量PCR试剂。本专利技术的试剂盒可采用以下方法实施根据GenBank提供的我国恙虫病东方体常见的Karp (M33004. 1)、Kato (GenBank) 及Gillim(DQ789360. 1)等优势型56KD特异基因保守序列进行BLAST比较进行探针及引物设计，设计探针和引物。采用ABI primer Express 2. 0软件设计探针和引物。设计引物56KDF、56KDR和探针56KDP，引物56KD F的序列见kquence NO. 4,56KD R的序列见 Sequence NO. 5，该对引物扩增产物为159bp，特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测无形体的实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒，包括特异性引物和特异性探针，所述特异性引物为ＭＦ和ＭＲ：ＭＦ其序列为Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．１，或者包含Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．１序列的向５’端或／和３’端延长的序列；ＭＲ其序列为Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．２，或者包含Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．２序列的向５’端或／和３’端延长的序列；所述特异性探针为：ＭＰ其序列为Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．３，或者包含Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＯ．３序列的向５’端或／和３’端延长的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽娟，亚红祥，梁长威，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11
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