本发明专利技术公开了体液循环DNA定量检测方法及试剂盒。选择人单拷贝看家基因β‑actin为检测靶基因，人工合成一长度为45bp的双链DNA片段，其中包含25bp与β‑actin基因相同的序列，并重组至质粒载体T‑Vector pMD20中获得重组质粒DNA作为内标以一定量投入待测体液样本中，与体液循环DNA同步进行保存、核酸提取纯化和荧光定量PCR扩增，以用于体液循环DNA定量分析。本发明专利技术通过特殊内标的设立，消除了体液样本分析前和分析中由于核酸降解、提取丢失和PCR扩增效率不同而造成的检测偏差，能够对体液循环DNA进行更加稳定准确的定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物样品检测领域，涉及体液循环DNA定量检测方法及试剂盒。
技术介绍
循环DNA(circulatingDNA)又称为无细胞状态DNA(cell-freeDNA)，存在于体液，如血液(血浆或血清)、尿液、脑脊液以及滑膜液的细胞外DNA。体液循环DNA的定量检测结果受到多种因素影响，会产生较大偏差，其中在核酸提取和长期保存过程中DNA的丢失和降解是其中两个最主要的影响因素。由于体液样本中循环DNA含量较低，因此需要采用基因扩增手段进行定量分析。基因扩增检测需要对核酸进行提取，由于提取过程中核酸的丢失，其定量结果无法反映体液循环DNA的真实水平；另一方面，各种核酸提取方法的提取效率存在很大差异，且核酸提取的重复性差，会在很大程度上影响定量检测结果的一致性。同时，无论是原始或纯化后的DNA样本，在长期保存过程中存在不同程度的降解，DNA年降解率甚至高达30％，这种变化对于定量检测结果的准确性和最终结论会产生巨大的影响。正因为如此，体液循环DNA定量检测分析一直都没有准确稳定的标准化方法。传统的体液循环DNA定量方法包括荧光定量PCR外标法和PicoGreen荧光法。荧光定量PCR外标法是针对人看家基因的单重荧光定量PCR，通过已知浓度的外部标准品建立标准曲线，对待测样本进行定量分析，由于标准品和待测样本分别在不同的试管中进行操作，其管间差异较大，影响定量结果的精密度和稳定性。PicoGreen荧光法采用PicoGreen荧光染料与双链DNA非特异性结合，结合后荧光强度显著增加，通过已知浓度的外部标准品建立标准曲线，从而对待测样本进行定量分析，由于是直接检测而未对DNA进行扩增，该方法检测灵敏度较荧光定量PCR法低，且存在较大的管间差异，影响定量结果的精密度和稳定性。为了解决上述问题，专利技术人前期设计了血浆循环DNA内标法定量检测，详见CN1811387，虽然较PCR外标法和PicoGreen荧光法有一定程度的改进，然而由于内标序列与引物序列设计的问题，造成内标与目的基因扩增目的片段长度不同，导致两者在双重荧光PCR反应过程中的扩增效率不一致，对其定量检测结果仍然存在显著影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种体液循环DNA定量检测方法。本专利技术的另一目的是提供一种体液循环DNA定量检测试剂盒。一种非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，包括：人工合成带有“A”粘性末端、长度为45bp的线性双链DNA片段，线性双链DNA片段中有25bp序列与β-actin基因相同，该线性双链DNA片段与T-VectorpMD20质粒载体重组后，得到长度为2781bp的环状重组质粒DNA，经限制性内切酶SmaI酶切为线性双链DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待测样本中作为内标(图1)；提取待测样本的总DNA，同时包含待测循环DNA和内标，采用双重实时荧光定量PCR法同时扩增循环DNA中的人看家基因β-actin和内标，按照内标的浓度计算被测体液中β-actin基因浓度，以此得出循环DNA含量；其中，双重实时荧光定量PCR反应体系中包含：共用下游引物、分别针对内标和β-actin基因的上游引物、以及分别标记JOE和FAM荧光基团的两个Taqman水解探针，JOE标记的探针针对β-actin基因，FAM标记的探针针对内标，同步进行基因扩增定量检测；所述的线性双链DNA片段序列如SEQIDNO.1所示；在双重实时荧光定量PCR扩增内标时，上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示，Taqman水解探针如SEQIDNO.4所示，5’端标记荧光报告基团FAM；在双重实时荧光定量PCR扩增β-actin基因时，上游引物如SEQIDNO.5所示，共用下游引物同内标扩增下游引物如SEQIDNO.3所示，Taqman水解探针序列如SEQIDNO.6所示，5’端标记荧光报告基团JOE。本专利技术所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：每200ul体液样本中加入浓度为1×104拷贝/ul的内标5ul，内标总拷贝数为5×104，充分混匀后立即检测或可长期-20℃以下冷冻保存。本专利技术所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：PCR扩增总反应体系25μl，其中，10×RealTimePCRbuffer2.5μl；dNTPs400μM；MgCl26mM；内标和β-actin基因的上游引物各200nM；共用下游引物700nM；内标和β-actin基因的TaqMan水解探针各100nM；TaKaRaEx热启动DNA聚合酶1U；循环DNA为2.5μl。本专利技术所述的非疾病诊断与治疗用途的循环DNA定量检测方法优选：PCR扩增反应条件：(1)95℃，5min(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，分别在JOE和FAM荧光信号通道上检测一次荧光信号，共40个循环。本专利技术所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：①双重实时荧光定量PCR结果采用7500systemSDS软件进行分析，分别在JOE和FAM两个通道设定基线和阈值，基线起始点为6或其它不小于5的数，终点为在荧光信号开始升高处再往前2个循环数，阈值设定在低荧光信号指数扩增区，以此确定目的基因β-actin和内标扩增Ct值，以Ctb和Cti表示；②采用LinRegPCR软件，计算各样本的PCR扩增效率，以E表示；③以下述公式计算血浆DNA含量，单位为拷贝/ml，并以1拷贝双链DNA≈3.3×10-3ng计算血浆DNA浓度，单位为ng/ml：Cb＝Ci×(1+E)(Cti-Ctb)公式中Cb和Ci分别表示血浆中β-actin基因和内标的起始模板浓度，单位为拷贝/ml，E表示PCR扩增效率，Ctb和Cti分别表示β-actin基因和内标的临界循环数。一种体液循环DNA定量检测试剂盒，其特征在于包含以下组分：(1)内标：含序列如SEQIDNO.1所示的线性双链DNA片段的T-VectorpMD20重组线性质粒；(2)如SEQIDNO.2所示的内标的上游引物；(3)如SEQIDNO.4所示且5’端标记荧光报告基团FAM的内标Taqman水解探针序列；(4)如SEQIDNO.5所示的β-actin基因的上游引物；(5)如SEQIDNO.6所示且5’端标记荧光报告基团JOE的β-actin基因的Taqman水解探针序列；(6)如SEQIDNO.3所示的内标和β-actin基因共用的下游引物。其中，内标的浓度优选1.0×104拷贝/μl。本专利技术试剂盒中还包含10RealTimePCRbuffer、dNTPs、MgCl2、TaKaRaEx热启动DNA聚合酶等组分。有益效果：针对现有技术存在的问题，本专利技术进行了如下改进：①重新设计了插入的双链DNA片段，CN1811387中为避免内标与β-actin基因相互干扰，设计的人工合成DNA片段长度为41bp，且与β-actin基因具有完全不同的序列，与人类基因组也完全不同源；本专利技术通过大量的实验探索，发现将线性双链DNA片段长度增长至45bp，且其中有25bp序列与β-actin基因相同不仅不会造成内标与β-actin基因相互本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，其特征在于包括：人工合成带有“A”粘性末端、长度为45bp的线性双链DNA片段，线性双链DNA片段中有25bp序列与β‑actin基因相同，该线性双链DNA片段与T‑Vector pMD20质粒载体重组后，得到长度为2781bp的环状重组质粒DNA，经限制性内切酶Sma I酶切为线性双链DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待测样本中作为内标；提取待测样本的总DNA，同时包含待测循环DNA和内标，采用双重实时荧光定量PCR法同时扩增循环DNA中的人看家基因β‑actin和内标，按照内标的浓度计算被测体液中β‑actin基因浓度，以此得出循环DNA含量；其中，双重实时荧光定量PCR反应体系中包含：共用下游引物、分别针对内标和β‑actin基因的上游引物、以及分别标记JOE和FAM荧光基团的两个Taqman水解探针，JOE标记的探针针对β‑actin基因，FAM标记的探针针对内标，同步进行基因扩增定量检测；所述的线性双链DNA片段序列如SEQ ID NO.1所示；在双重实时荧光定量PCR扩增内标时，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针如SEQ ID NO.4所示，5’端标记荧光报告基团FAM；在双重实时荧光定量PCR扩增β‑actin基因时，上游引物如SEQ ID NO.5所示，共用下游引物同内标扩增下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针序列如SEQ ID NO.6所示，5’端标记荧光报告基团JOE。...
【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，其特征在于包括：人工合成带有“A”粘性末端、长度为45bp的线性双链DNA片段，线性双链DNA片段中有25bp序列与β-actin基因相同，该线性双链DNA片段与T-VectorpMD20质粒载体重组后，得到长度为2781bp的环状重组质粒DNA，经限制性内切酶SmaI酶切为线性双链DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待测样本中作为内标；提取待测样本的总DNA，同时包含待测循环DNA和内标，采用双重实时荧光定量PCR法同时扩增循环DNA中的人看家基因β-actin和内标，按照内标的浓度计算被测体液中β-actin基因浓度，以此得出循环DNA含量；其中，双重实时荧光定量PCR反应体系中包含：共用下游引物、分别针对内标和β-actin基因的上游引物、以及分别标记JOE和FAM荧光基团的两个Taqman水解探针，JOE标记的探针针对β-actin基因，FAM标记的探针针对内标，同步进行基因扩增定量检测；所述的线性双链DNA片段序列如SEQIDNO.1所示；在双重实时荧光定量PCR扩增内标时，上游引物如SEQIDNO.2所示，下游引物如SEQIDNO.3所示，Taqman水解探针如SEQIDNO.4所示，5’端标记荧光报告基团FAM；在双重实时荧光定量PCR扩增β-actin基因时，上游引物如SEQIDNO.5所示，共用下游引物同内标扩增下游引物如SEQIDNO.3所示，Taqman水解探针序列如SEQIDNO.6所示，5’端标记荧光报告基团JOE。2.根据权利要求1所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，其特征在于：每200ul体液样本中加入浓度为1×104拷贝/ul的内标5ul，内标总拷贝数为5×104，充分混匀后立即检测或可长期-20℃以下冷冻保存。3.根据权利要求1或2所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，其特征在于：PCR扩增总反应体系25μl，其中，10RealTimePCRbuffer2.5μl；dNTPs400μM；MgCl26mM；内标和β-actin基因的上游引物各200nM；共用下游引...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘世扬，陈丹，徐建，黄珮珺，王芳，
申请(专利权)人：南京麦科林生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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