利用分子孔表征目标分子的方法技术

本发明专利技术涉及确定多个分析物的存在、不存在或一个或多个特征的新方法。本发明专利技术涉及将第一分析物偶联到含有检测器的膜，并使用检测器研究第一分析物。本发明专利技术还涉及将第二分析物偶联到所述膜上并研究第二分析物。在研究第二分析物之前，将第一分析物与所述膜解偶联。本发明专利技术还涉及多核苷酸测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及确定多个分析物的存在、不存在或确定多个分析物的一个或多个特征的新方法。本专利技术涉及将第一分析物与含有检测器的膜偶联，并使用检测器研究第一分析物。本专利技术还涉及将第二分析物偶联到膜上并研究第二分析物。在研究第二分析物之前，使第一分析物与膜解偶联。本专利技术还涉及多核苷酸的测序。
技术介绍
目前需要涉及广泛应用范围的快速且廉价的多核苷酸(例如DNA或RNA)测序和识别技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依靠扩增技术来产生大量的多核苷酸，并且需要大量的专门的荧光化学物质用于信号检测。跨膜孔(纳米孔)具有作为用于聚合物和各种小分子的直接的电生物传感器的巨大潜力。特别地，作为潜在DNA测序技术的纳米孔已成为最近焦点。当跨越纳米孔施加电位时，当分析物(例如核苷酸)在桶状体中短暂驻留一段时间后，电流发生变化。对核苷酸的纳米孔检测给出了已知标记的电流变化和持续时间。在链测序方法中，使单个多核苷酸链穿过孔，得到对核苷酸的识别。链测序可以包括使用多核苷酸结合蛋白来控制多核苷酸穿过孔的移动。之前已经证明，可以通过将分析物偶联到其中存在相关检测器的膜来实现超低浓度分析物传送。这进行检测所需的分析物的量降低了几个数量级(WO2012/164270)。
技术实现思路
专利技术人惊奇地证明，可以通过将分析物顺序偶联到其中存在检测器的膜，研究多个样品中的多个分析物。在研究第二分析物之前，使第一分析物与膜解偶联。因此，本专利技术提供了用于确定在两个或更多个样品中两个或更多个分析物的存在、不存在或一个或多个特征的方法，包括：(a)使用一个或多个锚将第一样品中的第一分析物偶联至膜；(b)使所述第一分析物与存在于所述膜中的检测器相互作用，并由此确定所述第一分析物的存在、不存在或一个或多个特征；(c)使所述第一分析物与所述膜解偶联；(d)使用一个或多个锚将第二样品中的第二分析物偶联至所述膜；以及(e)允许第二分析物与膜中的检测器相互作用，并由此确定第二分析物的存在、不存在或一个或多个特征。本专利技术还提供：-使用胆固醇偶联到膜上的分析物与膜解偶联的方法，包括使分析物与环糊精或其衍生物接触，并由此使分析物与膜解偶联；以及-用于确定在两个或更多个样品中两个或更多个分析物存在、不存在或一个或多个特征的试剂盒，包含(a)膜，(b)两个或更多个锚，其能够将所述两个或更多个分析物偶联至膜，和(c)一个或多个能够使所述两个或更多个分析物中的至少一个与所述膜解偶联的试剂。附图说明图1在(1)部分中显示了用于制备实施例2-4中使用的DNA的DNA模板(SEQIDNO：31，标记为A1，SEQIDNO：47标记为A2)。(2)部分显示了构建体X(在实施例2材料和方法中完整描述)的卡通图示——iSpC3间隔区显示为十字，四个5-硝基吲哚显示为灰色框，胆固醇系链显示为灰色椭圆形；标记b＝SEQIDNO：34，标记c＝SEQIDNO：35，标记d＝SEQIDNO：39，标记e＝SEQIDNO：41。(3)部分显示了构建体Y(在实施例2材料和方法中完整描述)的卡通图示——iSpC3间隔区显示为十字，四个5-硝基吲哚显示为灰色框，胆固醇系链显示为灰色椭圆形；标签b＝SEQIDNO：34，标签f＝SEQIDNO：37，标签g＝SEQIDNO：40，标签h＝SEQIDNO：30。图2显示了纳米孔以其未阻断状态存在(显示为浅灰色)时相比于当发生解旋酶DNA移动并且纳米孔被DNA链部分阻断(显示为黑色)时的时间百分比的实验时间进程(x轴标记＝时间(s)，y轴标记＝百分比(％))。如标记为X的箭头所示，在2400秒时加入DNA构建体X。如标记为Y的箭头所示，在7200秒时加入DNA构建体Y。图3显示了纳米孔以其未阻断状态存在(显示为浅灰色)时相比于当发生解旋酶DNA移动并且纳米孔被DNA链部分阻断(显示为黑色)时的时间百分比的部分实验时间进程(x轴标记＝时间(s)，y轴标记＝百分比(％))。如标记为X的箭头所示，在2700秒时加入DNA构建体X。如标记为F的箭头所示，在7500秒时进行缓冲液冲洗(10mL)。图4显示了纳米孔以其未阻断状态存在(显示为浅灰色)时相比于当发生解旋酶DNA移动并且纳米孔被DNA链部分阻断(显示为黑色)时的时间的分比的部分实验时间进程(x轴标记＝时间(s)，y轴标记＝百分比(％))。如标记为X的箭头所示，在2700秒时加入DNA构建体X。如标记为F的箭头所示，在6900秒时进行1分钟甲基-β-环糊精孵育然后冲洗(100μM，150μL)。图5显示了纳米孔以其未阻断状态存在(显示为浅灰色)时相比于当发生解旋酶DNA移动并且纳米孔被DNA链部分阻断(显示为黑色)时的时间百分比的部分实验时间进程(x轴标记＝时间(s)，y轴标记＝百分比(％))。如标记为X的箭头所示，在2400秒时加入DNA构建体X。如标记为F的箭头和白色框所示，在6600至6900秒之间进行10分钟甲基-β-环糊精孵育然后冲洗(100μM，150μL)。图6显示了纳米孔以其未阻断状态存在(显示为浅灰色)时相比于当发生解旋酶DNA移动并且纳米孔被DNA链部分阻断(显示为黑色)时的时间百分比的部分实验时间进程(x轴标记＝时间(s)，y轴标记＝百分比(％))。如标记为X的箭头所示，在2400秒时加入DNA构建体X。如标记为F的箭头和白色框所示，在6300至8100秒之间进行30分钟甲基-β-环糊精孵育然后冲洗(100μM，150μL)。图7显示了实施例5中使用的DNA构建体如何系在膜上(标记为i)。移位穿过纳米孔的DNA链标记为a(SEQIDNO：42，其3′端连接到四个iSpC3间隔区(标记为十字)，所述间隔区在另一端连接到SEQIDNO：43的5′端)。它与标记为b和c的两条链(分别为SEQIDNO：44和45)杂交。SEQIDNO：45在其3′端连接到6个iSp18间隔区(标记为d并显示为虚线)，所述间隔区在其另一端连接到两个胸腺嘧啶和生物素基团(标记为f)。生物素基团与链霉亲和素(标记为e)结合，所述链霉亲和素还结合到脱硫生物素(标记为g)。脱硫生物素连接到SEQIDNO：46的5′端，SEQIDNO：46的另一端具有3′胆固醇TEG(标记为h)。图8显示了实施例5中描述的实验的电流轨迹(y轴标记＝电流(pA)，x轴标记＝时间(s))。所述轨迹显示了偶联步骤和使用游离的生物素去除偶联的DNA。*1标记对应于脱硫生物素剂(desthiobiotinextender)的添加，*2对应于DNA构建体P的添加，*3对应于游离生物素的添加，*4对应于缓冲冲洗液(bufferflush)的添加。图9显示了图8中所示电流轨迹的三个放大区域(所有三个轨迹都具有以下轴标记-y轴标记＝电流(pA)，x轴标记＝时间(s))。轨迹A，B和C是图8中所示轨迹的一部分的连续快照图。*1标记对应于脱硫生物素剂的添加，*2对应于DNA构建体P的添加，*3对应于游离生物素的添加，*4对应于缓冲冲洗液的添加。序列表说明SEQIDNO：1显示了编码MS-B1突变MspA单体的密码子优化的多核苷酸序列。该突变体缺少信号序列并包括以下突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。SEQIDNO：2显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定两个或更多个样品中两个或更多个分析物的存在，不存在或一个或多个特征的方法，包括：(a)使用一个或多个锚将第一样品中的第一分析物偶联至膜；(b)使所述第一分析物与存在于所述膜中的检测器相互作用，由此确定所述第一分析物的存在、不存在或一个或多个特征；(c)使所述第一分析物与所述膜解偶联；(d)使用一个或多个锚将第二样品中的第二分析物偶联至所述膜；和(e)允许第二分析物与所述膜中的检测器相互作用，由此确定所述第二分析物的存在、不存在或一个或多个特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.04 GB 1406155.0;2014.09.10 GB PCT/GB2014/01.一种用于确定两个或更多个样品中两个或更多个分析物的存在，不存在或一个或多个特征的方法，包括：(a)使用一个或多个锚将第一样品中的第一分析物偶联至膜；(b)使所述第一分析物与存在于所述膜中的检测器相互作用，由此确定所述第一分析物的存在、不存在或一个或多个特征；(c)使所述第一分析物与所述膜解偶联；(d)使用一个或多个锚将第二样品中的第二分析物偶联至所述膜；和(e)允许第二分析物与所述膜中的检测器相互作用，由此确定所述第二分析物的存在、不存在或一个或多个特征。2.根据权利要求1所述的方法，其中(i)步骤(c)在步骤(d)之前执行，(ii)步骤(d)在步骤(c)之前执行，或(iii)步骤(c)和(d)同时执行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个锚包括多肽锚和/或疏水锚。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述疏水锚包括脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管或氨基酸。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括通过从所述膜去除所述一个或多个锚而从所述膜解偶联所述第一分析物。6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(c)包括使所述一个或多个锚与试剂接触，所述试剂对所述一个或多个锚具有比所述一个或多个锚对所述膜更高的亲和力。7.根据权利要求6所述的方法，其中(i)所述一个或多个锚包括胆固醇，并且所述试剂是环糊精或其衍生物或脂质；(ii)所述一个或多个锚包括链霉亲和素、生物素或脱硫生物素，并且所述试剂是生物素、脱硫生物素或链霉亲和素；或(iii)所述一个或多个锚包括蛋白质，并且所述试剂是特异性结合所述蛋白质的抗体或其片段。8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括使所述一个或多个锚与降低其偶联到所述膜的能力的试剂接触。9.根据权利要求8的所述方法，其中(i)所述一个或多个锚包括胆固醇，并且所述试剂是胆固醇脱氢酶，(ii)所述一个或多个锚包括脂质，并且所述试剂是磷脂酶；或(iii)所述一个或多个锚包括蛋白质，并且所述试剂是蛋白酶或脲。10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括通过从所述一个或多个锚分离所述第一分析物来使所述第一分析物从所述膜解偶联。11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括通过将所述第一分析物和所述一个或多个锚与试剂接触来使所述第一分析物从所述膜解偶联，其中所述试剂与所述第一分析物竞争结合到所述一个或多个锚。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述试剂是与所述第一分析物竞争杂交到所述一个或多个锚的多核苷酸。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括(i)将所述第一分析物和所述一个或多个锚与脲、三(2-羧乙基)膦(TCEP)，二硫苏糖醇(DTT)、链霉亲和素或生物素、UV光、酶或结合剂接触；(ii)加热所述第一分析物和一个或多个锚；或(iii)改变pH。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶是核酸外切酶、核酸内切酶或解旋酶。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述结合剂是酶、抗体或其片段或单链结合蛋白(SSB)。16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括使用与所述第一分析物分离的所述一个或多个锚将所述第二分析物偶联至所述膜。17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)和(d)包括通过使所述膜与所述第二分析物接触而使所述第一分析物与所述膜解偶联，使得所述第二分析物与所述第一分析物竞争结合到所述一个或多个锚并替换所述第一分析物。18.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括使用不同于与所述第一分析物分离的一个或多个锚的一个或多个锚将所述第二分析物偶联至所述膜。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)和(d)之间，所述方法包括从所述膜去除所述第一样品中的至少一些。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法包括从所述膜去除所有第一样品。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一分析物和第二分析物是相同分析物的两个实例。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一样品和所述第二样品是相同样品的两个实例。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜是两亲性层或固态层。24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于将所述第一分析物和/或第二分析物偶联到所述膜的所述一个或多个锚包括接头。25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一分析物和/或第二分析物暂时或永久地偶联至所述膜。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测器经由电装置或光学装置检测所述第一分析物和/或第二分析物。27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测器包括跨膜孔。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述跨膜孔是跨膜蛋白孔。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔来源于耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)、α-溶血素(α-...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·安东尼·克拉克，马里恩·路易丝·克劳福德，詹姆斯·怀特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB