用于基于酶相互作用持续时间选择多核苷酸的方法技术

一种用于选择多核苷酸的方法，所述方法包括：允许核酸处理酶沿样品中的多个多核苷酸移动限定的时间段，其中将所述酶加载到所述多个多核苷酸的每一个上，并且其中所述酶的一个或多个分子沿所述多个多核苷酸中的每一个移动；并基于在所述限定的时间段内所述酶是否到达所述多核苷酸的末端和/或与所述多核苷酸解结合来选择多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基于酶相互作用持续时间选择多核苷酸的方法
本专利技术一般涉及选择多核苷酸的方法。本专利技术一般还涉及修饰、分离和/或表征所选多核苷酸的方法。
技术介绍
基于大小选择多核苷酸对于许多应用如DNA和RNA的测序是重要的。在广泛的应用中需要快速和廉价的多核苷酸表征、鉴定、扩增和测序技术。多核苷酸的长度可有助于鉴定多核苷酸。多核苷酸的长度和完整性也可影响下游鉴定、扩增或测序应用的成功和快速性。为了最佳性能，许多高通量DNA测序仪需要一定大小的插入物文库。其中多核苷酸大小选择对其具有重要性的应用的其它实例包括确保正确的PCR产物形成、基因分型、DNA指纹分析、基因谱分析和提取限定大小的片段，例如在酶促消化多核苷酸之后。不同大小的DNA常规通过凝胶电泳检测。手动凝胶电泳方法有许多缺点，并且已经开发了分离和选择所需大小范围在100bp至50kb的DNA的自动化电泳仪器。官能化的顺磁性二氧化硅颗粒和聚乙二醇(PEG)在不同反应条件下可用于DNA大小选择。通常，这些方法只允许分离长度<1kb的DNA。也可使用利用固体基质的大小排阻方法，但同样，这些方法通常用于从1000kb+片段中去除短的<1kb的DNA片段。
技术实现思路
本专利技术人设计了一种基于酶的在包含多个多核苷酸的样品中选择多核苷酸的方法。本专利技术人已经认识到，核酸处理酶沿多核苷酸长度的移动速度是一致的，并且不取决于多核苷酸的长度。本专利技术人利用核酸处理酶的这一特性设计了方法，其中利用核酸处理酶的移动来选择不同长度的多核苷酸。所述方法包括基于在预定的时间段之后酶是否保持与多核苷酸结合，和/或基于酶是否到达末端和/或从多核苷酸上脱落来选择多核苷酸。所述方法可用于选择所需长度的多核苷酸。所述方法也可用于选择未受损的多核苷酸和/或完整的多核苷酸。所述方法的另一个用途是从仅在一端包含衔接子的多核苷酸和/或从未衔接的多核苷酸中选择在两端包含衔接子的多核苷酸。因此，本文提供了一种用于选择多核苷酸的方法，所述方法包括：(i)允许核酸处理酶沿样品中的多个多核苷酸移动限定的时间段，其中所述酶被加载到所述多个多核苷酸中的每一个上，并且其中所述酶的一个或多个分子沿所述多个多核苷酸中的每一个移动；以及(ii)基于在所述限定的时间段内所述酶是否到达所述多核苷酸的末端和/或与所述多核苷酸解结合来选择多核苷酸。所述样品可以例如包含PCR反应的产物；基因组DNA；内切核酸酶消化的产物；或DNA文库。所述方法可以包括以下中的一个或多个：-选择性修饰所需长度的多核苷酸或选择性修饰非所需长度的多核苷酸；-选择性修饰未受损的多核苷酸或选择性修饰受损的多核苷酸；-选择性修饰完整的多核苷酸或选择性修饰带切口的多核苷酸；-将所需长度的多核苷酸与其它多核苷酸分离；-将未受损的多核苷酸与受损的多核苷酸分离；-将完整的多核苷酸与带切口的多核苷酸分离；-表征所需长度的多核苷酸、未受损的多核苷酸和/或完整的多核苷酸；-对所需长度的多核苷酸、未受损的多核苷酸和/或完整的多核苷酸进行测序；-从所需长度的多核苷酸、未受损的多核苷酸和/或完整的多核苷酸中除去引物或衔接子；以及-使用所需长度的多核苷酸、未受损的多核苷酸和/或完整的多核苷酸进行基因分型、DNA指纹分析或图谱分析。还提供了：-一种表征多核苷酸的方法，所述方法包括：(i)执行如本文所述的方法；(ii)使跨膜孔与所选多核苷酸接触；(iii)在所述跨膜孔上施加电势差；以及(iv)进行一种或多种测量，所述测量指示相对于所述跨膜孔移动的多核苷酸的一种或多种特征，并且从而表征所述多核苷酸；-聚合物衔接子，其上结合有：(a)第一核酸处理酶；(b)第二核酸处理酶，其被结合使得其沿聚合物的移动受到阻碍，直到它与跨膜孔接触，其中所述第二核酸处理酶不阻碍所述第一核酸处理酶的移动；以及任选地(c)膜锚或孔锚；以及-一种用于分离和/或选择性修饰多核苷酸的试剂盒，其包含(a)包含多核苷酸和末端信号的衔接子和/或(b)如上所述的衔接子；并且包含以下组分中的任何一种或多种，包括任何组合：提取介质；核酸处理酶；为所述酶、酶辅因子和/或辅酶提供能量的核苷酸；包含用于所述核酸处理酶的燃料和/或辅因子的溶液；洗涤液，所述洗涤液不含用于所述核酸处理酶的燃料和/或辅因子；位点特异性内切核酸酶；和/或测序衔接子。附图说明应当理解，附图是为了说明的目的，而不旨在限制。图1显示了基本方案，其中核酸处理酶例如通过结合标签(例如蛋白质标签，如his标签或strep标签)结合到分离介质(例如微珠)上。(A)酶衔接子复合物结合到提取介质(例如微珠)上。(B)多核苷酸(例如双链DNA)(例如通过接合)连接至衔接子。(C)添加燃料和辅因子和使系统运行所需的时段。多核苷酸相对于酶移动(多核苷酸的方向由箭头指示)。如果遇到切口或到达链的末端，酶从多核苷酸解离。如果所有的酶都解结合，则多核苷酸能够扩散到溶液中。可通过多种方法防止释放的多核苷酸再结合于游离酶。例如，溶液中的捕获寡核苷酸可以被设计为结合和捕获酶，或结合和捕获游离多核苷酸。可替代地，可以设计衔接子的末端，使得酶不能加载(例如，不存在游离的单链位点)。(D)当系统被淬灭时，较长的多核苷酸链保持与酶结合，而较短链或受损链已经解离。解结合的多核苷酸(例如短链或受损链)可以通过常规方法，例如通过洗涤微珠与结合的多核苷酸分离，并任选地回收。结合的多核苷酸(例如，长链)可以以各种方式释放和回收。例如：酶可以通过加入燃料重新启动，并被允许到达链末端(步骤D回到步骤C)；酶可以与微珠解结合(例如变性酶、抑制标签结合、切割标签/酶等)；或者酶可以与DNA解结合(例如变性、高盐、使封闭复合物不封闭等)。对于大小级分选择，可以通过在步骤C>D>C>D…之间循环来回收任何所需大小的级分，其中循环是运行所需时间>淬灭>从洗涤中回收洗脱物。对于受损链的选择，如果在步骤D之后通过重新加入燃料和使酶流出多核苷酸的远端来洗脱长链，则任何具有导致酶被卡住的具有损伤的链(例如脱碱基区域、胸苷二聚体等)将保持与微珠结合，并且可以与由到达其末端的酶释放的解结合链分离。对于切口选择，随着酶在到其末端之前脱落，具有切口的链将由较短的链洗脱。因此，步骤D后长链的回收也选择不含切口的链(如果两端都负载酶，则在双链多核苷酸的至少一条链中)。图2显示了基本方案，其中多核苷酸(例如双链DNA)例如通过结合标签结合至微珠，并且到达多核苷酸远端的酶可以改变/置换标签，并因此可以用于将多核苷酸与微珠解结合。为了简单起见，该图显示了在双链多核苷酸上具有两个不同衔接子的实施例，一端具有酶，并且一端具有结合标签。(A)通过标签将DNA复合物与提取介质结合(例如，与链霉亲和素包被的微珠结合的生物素化寡核苷酸)。(B)添加燃料和辅因子和使系统运行所需的时段。酶沿多核苷酸移动(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于选择多核苷酸的方法，所述方法包括：/n(i)允许核酸处理酶沿样品中的多个多核苷酸移动限定的时间段，其中所述酶被加载到所述多个多核苷酸中的每一个上，并且其中所述酶的一个或多个分子沿所述多个多核苷酸中的每一个移动；以及/n(ii)基于在所述限定的时间段内所述酶是否到达所述多核苷酸的末端和/或与所述多核苷酸解结合来选择多核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180105 GB 1800187.51.一种用于选择多核苷酸的方法，所述方法包括：
(i)允许核酸处理酶沿样品中的多个多核苷酸移动限定的时间段，其中所述酶被加载到所述多个多核苷酸中的每一个上，并且其中所述酶的一个或多个分子沿所述多个多核苷酸中的每一个移动；以及
(ii)基于在所述限定的时间段内所述酶是否到达所述多核苷酸的末端和/或与所述多核苷酸解结合来选择多核苷酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中以相同方式将所述酶加载到所述多个多核苷酸的每一个上。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中衔接子连接至所述多个多核苷酸的每一个的一个或两个末端。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述酶与所述多个多核苷酸结合的初始步骤。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法包括将衔接子连接至所述多个多核苷酸的一个或两个末端，并且然后将所述酶与所述衔接子结合的初始步骤。


6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法包括在其中所述酶不沿所述多核苷酸移动的条件下，将预先结合有所述酶的衔接子连接至所述多个多核苷酸的每一个的一个或两个末端的初始步骤。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中防止所述酶的其它分子与所述多个多核苷酸结合。


8.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(i)中将与所述酶结合的捕获链加入所述样品中。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过启动所述酶的移动来开始所述限定的时间段。


10.根据权利要求9所述的方法，其中通过添加为所述酶、辅酶和/或辅因子提供能量的核苷酸来启动所述酶的移动。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过抑制所述酶的移动来终止所述限定的时间段。


12.根据权利要求11所述的方法，其中通过以下来终止所述酶的移动：(a)去除为所述酶、辅酶和/或辅因子提供能量的核苷酸；(b)加入酶抑制剂；(c)改变pH、温度或盐浓度；和/或(d)使所述酶变性。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)开始时，使所述酶的仅一个分子与所述多个多核苷酸的每一个结合。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(i)开始时，使所述酶的多个分子与所述多个多核苷酸的每一个结合。


15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(i)开始时，没有所述酶的分子与所述多个多核苷酸中的任一个结合。


16.根据权利要求15所述的方法，其中通过使所述多个多核苷酸与所述酶接触来开始所述限定的时间段。


17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(i)期间，所述酶的多个分子沿所述多个多核苷酸移动。


18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所选多核苷酸与未选择的多核苷酸分离。


19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中，使具有酶从末端移出的多核苷酸与没有酶从末端移出的多核苷酸分离。


20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将包含末端信号的衔接子连接至所述多个多核苷酸的每一个的一个或两个末端。


21.根据权利要求20所述的方法，其中：所述末端信号是选择标签，用于连接另一多核苷酸的隐藏位点，用于连接另一多核苷酸的暴露位点或防止核酸外切酶消化的帽；在步骤(i)中，当所述酶的分子到达所述多核苷酸的所述末端时，所述选择标签被置换，所述隐藏位点被暴露，所述暴露位点被去除或所述帽被去除；并且在步骤(ii)中，所述选择标签、所述隐藏位点、所述暴露位点或未封闭末端用于分离所述多核苷酸。


22.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个多核苷酸经由所述选择标签结合至微珠、柱或表面，并且所述选择标签被所述酶置换导致不再连接所述酶的多核苷酸从所述微珠、柱或表面释放。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述表面是包含跨膜孔的膜。


24.根据权利要求23所述的方法，其中通过重复步骤(i)和(ii)，分离在洗涤后保持结合至所述微珠、柱或表面的多核苷酸。


25.根据权利要求22或24所述的方法，其中通过以下方式从所述微珠、柱或表面回收与所述微珠、柱或表面保持结合的所述多核苷酸：重新开始所述酶的移动并允许所述酶到达所述多核苷酸的末端；或使所述多核苷酸与微珠、柱或表面解结合。


26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中在步骤(i)开始时，没有所述酶的分子与所述多个多核苷酸中的任一个结合，并且通过添加所述酶和为所述酶、辅酶和/或辅因子提供能量的核苷酸来启动所述限定的时间段。


27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶被标记。


28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶结合至微珠、柱或表面。


29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述限定的时间段通过冲洗所述微珠、柱或表面而终止。


30.根据权利要求1至18和26至29中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·约翰·赫伦，瑞贝卡·维多利亚·鲍恩，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB