筛选跨膜靶蛋白适配体的细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用技术

本公开涉及一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN‑LOSS细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用，该方法包括以下步骤：S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系；S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子，将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN‑LOSS细胞SELEX筛选。该方法能够有效地在活细胞状态下针对各种跨膜靶蛋白筛选出具有高特异性和亲和力的活性适配体。

SELEX method for the screening of transmembrane target aptamers and its application

【技术实现步骤摘要】
筛选跨膜靶蛋白适配体的细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用
本公开涉及一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法及跨膜靶蛋白适配体及其应用。
技术介绍
核酸适体(Nucleicacidaptamers)是采用指数富集配体的系统进化技术(SELEX)从随机单链核酸库中筛选出的能与不同靶分子高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA。核酸适体通过特定的空间构象，与靶分子相互作用而发生特异性结合，与抗原-抗体结合的原理相似且与靶分子的亲和力可与抗原-抗体相当。核酸适体可以通过人工体外筛选和合成，具有快速获得、易于制备及稳定性可控的优势。此外，不论是细胞、动物及临床试验中，迄今均未发现核酸适体具有明显的毒性和免疫原性。因此，核酸适体被认为是可与抗体相媲美的分子，在疾病的诊断和治疗方面极具应用前景。2004年12月，第一个获得美国FDA批准上市的核酸适体药物Macugen是一种能特异性结合并阻断VEGF165功能的核酸适体，它能抑制VEGF信号转导通路，可有效抑制新生血管的生成，主要用于治疗老年性视网膜黄斑营养不良等。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/nS1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系；/nS2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子，将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选跨膜靶蛋白适配体的GAIN-LOSS细胞SELEX方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1.采用具有跨膜靶蛋白的表达的初始细胞系构建所述跨膜靶蛋白过表达的GAIN正选细胞系和所述跨膜靶蛋白敲除的LOSS反选细胞系；
S2.将所述GAIN正选细胞系作为目标靶分子，将所述LOSS反选细胞系作为消减靶分子进行GAIN-LOSS细胞SELEX筛选。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中，所述GAIN正选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量与所述初始细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量的比值为(20～100)：1，所述LOSS反选细胞系的所述跨膜靶蛋白的表达量为0。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中，所述GAIN正选细胞系通过将跨膜靶蛋白基因转导到所述初始细胞系进行构建；
所述LOSS反选细胞系通过CRISPR-Cas9基因组编辑将所述初始细胞系的跨膜靶蛋白基因敲除的方式进行构建。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述GAIN-LOSS细胞SELEX筛选包括以下步骤：
S201.将所述GAIN正选细胞系与随机ssDNA文库混合进行阳性孵育，去除未与所述GAIN正选细胞系结合的ssDNA，得到正向筛选的适配体文库；
S202.将所述LOSS反选细胞系与所述正向筛选的核酸适体文库混合进行阴性孵育，收集未与所述LOSS反选细胞系结合的ssDNA，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保亭，刘振丽，于媛媛，吕诚，
申请(专利权)人：北京和理咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11