绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用技术

本发明专利技术提供了一种绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用，涉及分子生物学DNA标记技术和遗传学应用技术领域。该筛选方法包括查找绵羊全基因组中所有染色体上四碱基重复的微卫星标记，然后设计扩增这些微卫星标记的引物；扩增后保留扩增条带单一且清晰的微卫星标记，然后使用5’端融合有正向通用引物的正向引物、5’端标记荧光标记的正向通用引物和反向引物扩增绵羊样本的微卫星位点，对微卫星标记进行多态性鉴定，得到所述绵羊四碱基重复微卫星标记。该筛选方法能够得到多态性好的绵羊四碱基微卫星标记。

Four base repeat microsatellite marker of sheep and its screening method, primer set and Application

【技术实现步骤摘要】
绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用
本专利技术涉及分子生物学DNA标记技术和遗传学应用
，尤其是涉及一种绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用。
技术介绍
微卫星标记(Microsatellitemarker)以其长度的多态性而著称，由于其具有稳定性好，多态信息含量丰富，呈共显性遗传，重复性好且易于实现分析自动化等优势，是其他遗传标记所不能替代的，因而被广泛应用于动植物的遗传图谱构建、遗传多样性评价、数量性状定位、亲子鉴定和个体识别等方面。就微卫星分子遗传标记技术而言，其中最重要的是如何获得标记数量多、遗传多态性高且可以稳定扩增的微卫星位点，这在群体遗传学研究中的应用极为重要。目前绵羊的微卫星位点比较多，但基本上均是为二碱基重复单元的微卫星位点，绵羊的四碱基重复微卫星标记目前还未见报道。相对于二碱基或三碱基重复微卫星位点，四碱基重复微卫星最大的优势是在PCR扩增过程中不容易产生因PCR扩增链滑脱产生的影子带，因而四碱基重复微卫星更容易从电泳峰图上读取等位基因进行统计分析。绵羊微卫星标记在绵羊的遗传多样性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(a)在绵羊全基因组中进行BLAST比对，查找所有染色体上四碱基重复的微卫星标记；/n(b)设计用于扩增步骤(a)筛选得到的微卫星标记的引物，所述引物包括正向引物和反向引物；/n(c)对步骤(a)筛选得到的微卫星标记进行PCR扩增，筛选出PCR扩增产物条带单一且清晰的微卫星标记；/n(d)选取至少20个绵羊样本，对步骤(c)筛选得到的微卫星标记进行三引物PCR扩增，所述三引物PCR扩增包括使用如下引物扩增微卫星标记：5’端融合有正向通用引物的所述正向引物、5’端标记荧光标记的所述正向通用引物和所述反向引物；/n(e)通过...

【技术特征摘要】
1.一种绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)在绵羊全基因组中进行BLAST比对，查找所有染色体上四碱基重复的微卫星标记；
(b)设计用于扩增步骤(a)筛选得到的微卫星标记的引物，所述引物包括正向引物和反向引物；
(c)对步骤(a)筛选得到的微卫星标记进行PCR扩增，筛选出PCR扩增产物条带单一且清晰的微卫星标记；
(d)选取至少20个绵羊样本，对步骤(c)筛选得到的微卫星标记进行三引物PCR扩增，所述三引物PCR扩增包括使用如下引物扩增微卫星标记：5’端融合有正向通用引物的所述正向引物、5’端标记荧光标记的所述正向通用引物和所述反向引物；
(e)通过分析步骤(d)的扩增产物来对微卫星标记进行多态性鉴定，得到所述绵羊四碱基重复微卫星标记。


2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)中，所述微卫星标记的核心序列重复单元数目≥7；
优选地，同一染色体上任意两个微卫星标记的距离≥200kb；
优选地，同一染色体上微卫星标记的数量≤3。


3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(b)中，所述引物所在区域在全基因组中无同源序列；
优选地，引物长度为18～30bp；
优选地，引物GC含量为35～60％；
优选地，引物的退火温度为50～65℃；
优选地，扩增片段长度为100～400bp。


4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(c)中至少对两个绵羊样品进行PCR扩增；
优选地，步骤(c)还包括对PCR扩增产物条带单一且清晰的微卫星标记进行测序。


5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述正向通用引物包括M13正向通用引物；
优选地，所述M13正向通用引物包括M13(-47)、M13(-40)或M13(-21)；
优选地，所述M13正向通用引物包括M13(-21)，所述M13(-21)的序列如SEQIDNO.97所示；
优选地，所述荧光标记包括2～5种不同颜色的荧光标记，每条正向通用引物的5’端标记一种颜色的荧光标记，每个位点使用标记有同一颜色荧光标记的通用引物扩增；
优选地，所述荧光标记包括3种不同颜色的荧光标记；
优选地，荧光标记包括FAM、Tamra和Hex；
优选地，选取25～35个绵羊样本，对步骤(c)筛选得到的微卫星标记进行三引物PCR扩增；
优选地，所述三引物PCR扩增的反应体系中，5’端融合有正向通用引物的所述正向引物、5’端标记荧光标记的所述正向通用引物和所述反向引物的摩尔比为(0.8～1.2)：(1.2～2)：2；
优选地，所述三引物PCR扩增的扩增程序包括先以57～59℃退火扩增25～35个循环，再以52～54℃退火扩增5～15个循环；
优选地，先以58℃退火扩增25～35个循环；
优选地，再以53℃退火扩增5～15个循环。


6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，对微卫星标记进行多态性鉴定，包括分析微卫星标记的等位基因数、多态信息含量、期望杂合度、观测杂合度和哈迪-温伯格平衡中的一种或多种；
优选地，等位基因数至少为5个：
优选地，多态信息含量至少为0.5；
优选地，观测杂合度至少为0.5；
优选地，期望杂合度至少为0.5；
优选地，哈迪-温伯格平衡的P值至少为0.05；
优选地，对步骤(d)的扩增产物进行毛细管电泳，然后对采集的数据进行荧光颜色的分离，利用分型标准物计算等位基因大小，得到各基因组的基因分型数据，然后对绵羊四碱基重复微卫星进行多态性鉴定。


7.一组绵羊四碱基重复微卫星标记，其特征在于，包括Ovr1402、Ovr1602、Ovr2001、Ovr0501、Ovr2101、Ovr0201、Ovr0702、Ovr0503、Ovr1002、Ovr2204、Ovr0502、Ovr1401、Ovr2304、Ovr1901、Ovr2604、Ovr2601、Ovr1101、Ovr1003、Ovr1601、Ovr2401、Ovr2202、Ovr0602、Ovr2103、Ovr1702、Ovr1501、Ovr2606、Ovr1001、Ovr1801、Ovr2102、Ovr0801、Ovr0802和Ovr0902中的一个或多个微卫星标记；
所述Ovr1402的微卫星重复基序为(ATAG)9，所述Ovr1402的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，或为与SEQIDNO.1同源性90％以上的序列；
所述Ovr1602的微卫星重复基序为(CTAT)7，所述Ovr1602的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列，或为与SEQIDNO.2同源性90％以上的序列；
所述Ovr2001的微卫星重复基序为(ATAG)6，所述Ovr2001的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示序列，或为与SEQIDNO.3同源性90％以上的序列；
所述Ovr0501的微卫星重复基序为(ATAG)12，所述Ovr0501的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示序列，或为与SEQIDNO.4同源性90％以上的序列；
所述Ovr2101的微卫星重复基序为(CTAT)5，所述Ovr2101的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示序列，或为与SEQIDNO.5同源性90％以上的序列；
所述Ovr0201的微卫星重复基序为(CTAT)8，所述Ovr0201的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示序列，或为与SEQIDNO.6同源性90％以上的序列；
所述Ovr0702的微卫星重复基序为(ATAG)15，所述Ovr0702的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示序列，或为与SEQIDNO.7同源性90％以上的序列；
所述Ovr0503的微卫星重复基序为(CTAT)7，所述Ovr0503的核苷酸序列为SEQIDNO.8所示序列，或为与SEQIDNO.8同源性90％以上的序列；
所述Ovr1002的微卫星重复基序为(ATAG)13，所述Ovr1002的核苷酸序列为SEQIDNO.9所示序列，或为与SEQIDNO.9同源性90％以上的序列；
所述Ovr2204的微卫星重复基序为(CTAT)9，所述Ovr2204的核苷酸序列为SEQIDNO.10所示序列，或为与SEQIDNO.10同源性90％以上的序列；
所述Ovr0502的微卫星重复基序为(ATAG)7，所述Ovr0502的核苷酸序列为SEQIDNO.11所示序列，或为与SEQIDNO.11同源性90％以上的序列；
所述Ovr1401的微卫星重复基序为(CTAT)7，所述Ovr1401的核苷酸序列为SEQIDNO.12所示序列，或为与SEQIDNO.12同源性90％以上的序列；
所述Ovr2304的微卫星重复基序为(ATAG)11，所述Ovr2304的核苷酸序列为SEQIDNO.13所示序列，或为与SEQIDNO.13同源性90％以上的序列；
所述Ovr1901的微卫星重复基序为(CTAT)7，所述Ovr1901的核苷酸序列为SEQIDNO.14所示序列，或为与SEQIDNO.14同源性90％以上的序列；
所述Ovr2604的微卫星重复基序为(CTAT)10，所述Ovr2604的核苷酸序列为SEQIDNO.15所示序列，或为与SEQIDNO.15同源性90％以上的序列；
所述Ovr2601的微卫星重复基序为(CTAT)10，所述Ovr2601的核苷酸序列为SEQIDNO.16所示序列，或为与SEQIDNO.16同源性90％以上的序列；
所述Ovr1101的微卫星重复基序为(CTAT)15，所述Ovr1101的核苷酸序列为SEQIDNO.17所示序列，或为与SEQIDNO.17同源性90％以上的序列；
所述Ovr1003的微卫星重复基序为(ATAG)10，所述Ovr1003的核苷酸序列为SEQIDNO.18所示序列，或为与SEQIDNO.18同源性90％以上的序列；
所述Ovr1601的微卫星重复基序为(ATAG)10，所述Ovr1601的核苷酸序列为SEQIDNO.19所示序列，或为与SEQIDNO.19同源性90％以上的序列；
所述Ovr2401的微卫星重复基序为(ATAG)11，所述Ovr2401的核苷酸序列为SEQIDNO.20所示序列，或为与SEQIDNO.20同源性90％以上的序列；
所述Ovr2202的微卫星重复基序为(ATAG)12，所述Ovr2202的核苷酸序列为SEQIDNO.21所示序列，或为与SEQIDNO.21同源性90％以上的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：马惠海，闫守庆，胡明月，赵中利，曹阳，刘正喜，鲍志鸿，巩俊明，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22