一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法技术

本发明专利技术涉及一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：(1)针对待检测的目的基因，确定富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域，并对该区域设计引物与taqman探针；(2)将待检测样本分成两份，其中一份经甲基化敏感性限制性内切酶处理，另一份不处理；(3)利用数字PCR芯片分别对两份样本进行定量检测，最终计算出样本中目的基因的甲基化程度。本发明专利技术实现了对基因甲基化程度绝对定量的方法，该方法能够准确的定量出待检测基因的甲基化拷贝数所占的百分比；检测灵敏度高；检测过程简单；且检测时间短。

Quantitative method for gene methylation degree based on digital PCR chip

The invention relates to a quantitative method, the methylation status of digital PCR based on chip includes: (1) for detection of the target gene, determine the rich methylation sensitive restriction enzyme cleavage site region, and the area of the design of primers and TaqMan probe; (2) the test sample is divided into two parts, including a copy of the methylation sensitive restriction endonuclease, another is not processing; (3) using digital PCR chip respectively quantitative detection of two samples, finally calculate the methylation level of target gene in the sample. The invention realizes the method of gene methylation in absolute quantification, the method can accurately quantify the percentage of methylation of genes to detect copy number accounted for; high sensitivity; the detection process is simple and short detection time.

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法
本专利技术属于基因甲基化检测领域，特别涉及一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法。
技术介绍
DNA甲基化主要是指胞嘧啶(C)5位碳的甲基化，形成m5C。哺乳动物DNA中，呈甲基化状态的碱基对m5CG会对基因的表达起到限制作用。近年来的研究发现，DNA甲基化与恶性肿瘤发生与发展密切相关。DNA甲基化水平在肿瘤发生发展中的改变主要表现为局部高甲基化和基因组的低甲基化。首先是抑癌基因的启动子区，在正常细胞中该区域处于低甲基化或者未甲基化状态，基因可以正常表达，从而不断的抑制肿瘤发生。而在癌细胞中，基因的启动子区域会呈现高度甲基化状态，抑制了基因的表达，并最终导致癌症的发生。其次是对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，其甲基化水平降低将造成这些基因的激活，细胞过度增殖，并最终导致癌症。传统甲基化检测方法中，基于测序的方法虽然检测结果往往被视为金标准，但其过分依赖于昂贵的仪器和复杂的操作过程，且无法检测出微量甲基化拷贝。而另一些方法，例如甲基化特异性高分辨率溶解曲线法，荧光定量PCR法等，虽然简便快捷，但检测结果不够精确，灵敏度不够高。以上这些缺点都限制了上述检测手段在实际临床检测中的应用价值。数字PCR芯片技术，作为一种能够精确检测到单个DNA分子的技术，具有很多优点。例如：一、能够对起始样品进行绝对定量，而不需要依赖标准品，不需要预先绘制标准曲线。二、灵敏度高，检测限能够达到101数量级个拷贝。三、可以精确定量小拷贝数变化，准确识别DNA分子的微小浓度差异。这些优点都使得数字PCR芯片具有比传统定量方法更优越的性能，从而更加适用于生化检测。甲基化敏感性限制性内切酶，是一类能够特异性识别其切割位点甲基化状态的限制性内切酶，当其切割位点状态为甲基化时，切割不发生。当其切割位点状态为非甲基化时，切割发生。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，该方法实现了对基因甲基化程度绝对定量的方法，该方法能够准确的定量出待检测基因的甲基化拷贝数所占的百分比；检测灵敏度高；检测过程简单；且检测时间短。本专利技术的一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：(1)针对待检测的目的基因，确定富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域，并对该区域设计引物与taqman探针；(2)将待检测样本分成两份，其中一份经甲基化敏感性限制性内切酶处理，另一份不处理；(3)利用数字PCR芯片分别对两份样本进行定量检测，最终计算出样本中目的基因的甲基化程度。所述步骤(1)中的taqman探针两端分别修饰FAM荧光分子和BHQ荧光淬灭剂分子。所述步骤(3)中的数字PCR芯片为采用PDMS制作的阵列式数字PCR微流体芯片。采用PDMS制作的阵列式数字PCR微流体芯片不依赖专用的数字PCR设备，分液和读取均在芯片上完成，大大降低了甲基化的数字PCR检测成本。所述步骤(3)中的PCR芯片反应体系为：10μL罗氏480probsmastermix，0.5μL浓度为10μM前引物与后引物，0.5uL浓度为10μM的taqman探针，并加水至总体积为20μL。所述步骤(3)中的计算方法为：统计两份样本中的拷贝数，从未经处理的样本的定量结果得到甲基化与非甲基化等位基因总数，从经处理的样本的定量结果得到样本中的甲基化拷贝数，两者相除，最终得到样本中甲基化等位基因的百分比，即样本的甲基化程度。本专利技术的技术方案具体为：第一步：欲检测的目的基因寻找到富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域设计特异性引物与taqman探针。首先，确定要研究的目的基因相应的区域，在该区域中找到富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的序列，以该序列为模板进行引物设计，并同时设计出相应的taqman探针。第二步：对样本进行限制性内切酶处理。待检测样本为从细胞，组织，血液等中提取的DNA，将待检测样本均分为相等的两份：A部分与B部分。B部分中按照相应的甲基化敏感性限制性内切酶的使用说明，将B部分样本进行限制性内切酶处理，B部分样本中的非甲基化拷贝将被限制性内切酶切割消化，只剩下甲基化拷贝。A部分不使用甲基化敏感性限制性内切酶处理。两部分样本在进行完上述步骤后保存待用。第三步：利用PDMS材料制作的阵列式数字PCR微流体芯片对待检测基因的甲基化程度进行绝对定量检测。将第二步中处理过的A部分与B部分样本，分别加入10uL罗氏480probsmastermix，0.5uL浓度为10uM前引物与后引物，0.5uL浓度为10uM的taqman探针，并加水至总体积为20uL。这样就为A，B两部分样本分别配制好了PCR反应体系。使用本专利技术的数字PCR芯片阵列式数字PCR微流体芯片分别对A与B两部分样本进行绝对定量检测。经过PCR过程之后，统计出A部分与B部分样本中的拷贝数，具体计算方法为：设芯片亮点数目设为n，设芯片总点数设为N。由于DNA分子在反应仓中的个数x的分布满足泊松分布，则根据泊松分布的分布函数：每个无荧光信号的反应仓含有0个目标分子，则：可以推出泊松分布的期望值λ的计算公式：当反应仓中里分子数x>＝1个时，该反应仓都会变成是亮点，所以有下面式子：得出：λ是泊松分布中期望，指的就是所有的反应仓里面出现分子数目的期望值，所以最后一步只需要用λ乘以总反应仓的数目N即可得出检测到目的序列的总拷贝数copy_number：copy_number＝λ×N若欲得出被检测物的初始浓度，只需将总拷贝数copy_number除以初始样本的体积v：至此，精确地得到了待检测样本中目的序列的拷贝数与浓度。从A部分的结果中得到了甲基化与非甲基化等位基因拷贝总数，从B部分的定量结果中，得到样本中甲基化等位基因拷贝数。两者相除，便最终得到待测样本中甲基化等位基因的百分比，即样本的甲基化程度。本专利技术利用PDMS阵列式数字PCR芯片与甲基化特异性限制性内切酶相结合，设计出一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法。对DNA甲基化拷贝检测灵敏度能够达到10个拷贝。不需要依赖标准品，不需要预先绘制标准曲线，能够对目的基因的甲基化程度进行绝对定量。本专利技术可以精确定量小拷贝数变化，准确识别DNA分子的微小浓度差异。从而准确的区分出甲基化程度的微小差异。有益效果本专利技术对DNA甲基化拷贝检测灵敏度能够达到10个拷贝，灵敏度高；整个分液，扩增，读取过程完全在同一张阵列式数字PCR芯片上完成，不需要额外的数字PCR专用设备；不需要依赖标准品，不需要预先绘制标准曲线，能够对目的基因的甲基化程度进行绝对定量；检测灵敏度高；检测过程简单；且检测时间短；该方法能够满足临床需求，在医学方面具有很好的应用前景。附图说明图1为本专利技术的检测流程示意图；图2为实施例1中数字PCR芯片中发生的实际反应；图3为实施例1中样本1的数字PCR结果。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(1)引物与探针的设计与准备首本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：(1)针对待检测的目的基因，确定富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域，并对该区域设计引物与taqman探针；(2)将待检测样本分成两份，其中一份经甲基化敏感性限制性内切酶处理，另一份不处理；(3)利用数字PCR芯片分别对两份样本进行定量检测，最终计算出样本中目的基因的甲基化程度。

【技术特征摘要】
2016.12.26 CN 20161121796511.一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，包括：(1)针对待检测的目的基因，确定富含甲基化敏感性限制性内切酶切割位点的区域，并对该区域设计引物与taqman探针；(2)将待检测样本分成两份，其中一份经甲基化敏感性限制性内切酶处理，另一份不处理；(3)利用数字PCR芯片分别对两份样本进行定量检测，最终计算出样本中目的基因的甲基化程度。2.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法，其特征在于：所述步骤(1)中的taqman探针两端分别修饰FAM荧光分子和BHQ荧光淬灭剂分子。3.根据权利要求1所述的一种基于数字PCR芯片的基因甲基化程度定量方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛红菊，武振华，赵建龙，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31