本发明专利技术公开了一种截短型丙型肝炎病毒HCV NS3抗原，是HCV基因组中NS3全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述HCV NS3重组抗原蛋白制备方法是：构建用于表达截短型丙型肝炎病毒HCV NS3抗原的大肠杆菌优化密码子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，将所述密码子基因片段经双酶切，再与经同样酶切后的表达载体连接，获得重组表达质粒，以常规方法使抗原表达，经纯化获得。本发明专利技术的抗原蛋白灵敏度高、特异性强，用其检测HCV抗体，与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高达97％。预示该抗原可以应用于多克隆或单克隆抗体、丙型肝炎病毒检测试剂盒的制备，具有良好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种丙型肝炎病毒抗原及其制备与应用，尤其涉及一种截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原及其制备与应用，属于分子生物学
技术介绍
丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染最显著的临床特征就是引起慢性感染，约有70％的丙肝有可能发展成慢性肝炎，20％发展成肝硬化，12％发展成肝癌，危害十分地严重。全球HCV的感染率为2.8％，约有1.85亿人携带HCV。我国属于HCV低流行区，预计我国HCV感染者1000万，而且每年的新发病例数不断上升。自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于HCV相关疫苗的研究工作。HCV基因组长约9.6kb，编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白(C、E1、E2、P7)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。但因病毒RNA在血液含量较低且非常不稳定，HCV基因组变异率较高，病毒准种多，缺乏理想的体外感染细胞模型，而导致预防性疫苗缺乏保护性抗体。由于目前没有有效治疗丙型肝炎的药物，因此早期发现HCV感染，准确判断病毒亚型及患者感染状况，是有效防控丙肝的重要手段。目前，我国控制该疾病蔓延的手段主要采用血液筛查，这也使得研究开发快速灵敏的丙型肝炎病毒检测试剂盒具有十分重要的临床意义。已报到的有关HCV检测的ELISA试剂盒主要包含C区、NS3区、NS4区的抗原，有的也包含NS5区的抗原。但对NS5区抗原作用的评价，却褒贬不一。Core、C33(NS3)抗原在抗原反应性上有很好的互补性。其联合检出率平均值可在99％左右，是研究HCV诊断试剂的重点区段。NS3基因位于HCV全基因序列的3420-5312nt位点，编码含有631aa(1026-1656aa)的NS3蛋白p72，其氨基酸序列相对保守，与黄病毒及瘟病毒相应区段有较高的同源性。NS3蛋白具有多种蛋白酶活性，在病毒多蛋白前体的加工及各蛋白的转化成熟过程中均发挥重要作用，非结构区各蛋白的产生均有赖于该蛋白对病毒多蛋白前体的酶解和修饰。免疫学研究发现，NS3蛋白的抗原性和免疫原性相对较强，是检测HCV感染的主要抗原之一，在诱导机体的抗病毒免疫方面也有一定的意义。感染者对NS3的抗体反应不仅出现早，且滴度高、特异性强，抗体转阳时间一般为8周左右，几乎与抗HCV同步。目前，单片段HCV-NS3抗体的检出率为76.47％-89.47％。在经对丙型肝炎病毒的免疫学信息研究发现，HCV在患者血液中的抗体主要是对以下抗原表位的免疫应答产生，Core(2-120aa)，NS3(1026-1457aa)，NS4(1694-1735aa)，NS4(1859-1931aa)，NS5A(2212-2313aa)。但在应用中，存在诊断试剂加入的NS3全长基因表达的蛋白过大，与其它优势抗原表位串联表达后，会因空间结构的遮挡而使部分抗原失去活性的缺陷。基于此，寻找和确立与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高、灵敏度高的截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，对开发更加有效的早期诊断丙型肝炎病毒HCV的多克隆抗体或单克隆抗体和丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原及其制备与应用。为实现上述目的，本专利技术人查找阅读国内外HCVNS3文献，并根据HCVsequencesdatabase(http://hepatitis.ibcp.fr.)，筛选出6条分属于HCV6种基因型的NS3抗原序列，通过序列对比、分析，筛选得到NS31252-1526aa截短型HCVNS3氨基酸序列，查找NCBI得到对应核苷酸序列，并进一步选择大肠杆菌的偏好性密码子设计并合成截短型NS3抗原基因核苷酸序列。本专利技术所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，其特征在于：所述抗原是HCV基因组中NS3全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，对应核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQIDNO.2的核苷酸序列不同的序列；对所述SEQIDNO.2所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。上述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，优选是HCV基因组中NS3全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，对应核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术公开了一种用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大肠杆菌优化密码子，其特征在于：所述密码子核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的氨基酸对应SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸。本专利技术所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3重组抗原蛋白制备方法，步骤是：(1)构建用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大肠杆菌优化密码子，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)将所述密码子基因片段经BamHI和XhoI双酶切，酶切产物纯化回收后，与经同样限制性内切酶酶切后的表达载体pET28a连接，获得重组表达质粒(构建的表达载体需用PCR法鉴定，以证明截短型NS3抗原基因片段已获正确插入)；(3)通过CaCl2法将制得的重组表达质粒转入大肠杆菌感受态DH5α，涂布于含50μg/mlKan+的LB琼脂培养基上，筛选得到阳性质粒；(4)将步骤(3)中得到的阳性质粒，通过CaCl2法转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于含Kan+的LB琼脂培养基上，常规培养；挑取单菌落接种至Kan+的LB液体培养基中，培养过夜；次日，转接于新鲜的含Kan+的LB液体培养基中，培养至OD600≈0.6时加入IPTG至终浓度为0.2-0.8mM，37℃诱导培养12-16h，获得含HCVNS3重组抗原蛋白的全菌液(取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明截短型NS3重组抗原已得到高效表达)，经过亲和镍柱层析纯化和离子交换柱纯化，即得到高纯度的截短型HCVNS3重组抗原。一种多克隆抗体或单克隆抗体，其特征在于：所述抗体是能与截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。将制得的截短型HCVNS3重组抗原蛋白免疫小鼠(注射小鼠)，经常规单克隆抗体制备方法，纯化分离，即可制备出所述重组抗原特异性结合的多克隆抗体或单克隆抗体。或者用制得的截短型HCVNS3重组抗原包被酶联板，采用间接酶联免疫法建立抗HCVNS3抗体技术，检测其临床意义。本专利技术所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原在制备丙型肝炎病毒HCV抗原或抗体检测试剂盒中的应用。本专利技术所述多克隆抗体或单克隆抗体在制备检测丙型肝炎病毒HCV抗原试剂盒中的应用。本专利技术所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原和其多克隆抗体或单本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种截短型丙型肝炎病毒HCV NS3抗原，其特征在于：所述抗原是HCV基因组中NS3全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码相同序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQ ID NO.2的核苷酸序列不同的序列；对所述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，其特征在于：所述抗原是HCV基因组中NS3
全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQIDNO.1
所示，对应核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；与SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码相同序
列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而与SEQIDNO.2的核苷酸序列不同的序列；对所述SEQ
IDNO.2所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原，其特征在于：所述抗原是HCV
基因组中NS3全长基因编码的第1252～1526aa片段非结构蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列
如SEQIDNO.1所示，对应核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.一种用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大肠杆菌优化密码
子，其特征在于：所述密码子核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的氨基酸对应SEQID
NO.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸。
4.一种截短型丙型肝炎病毒HCVNS3重组抗原蛋白制备方法，步骤是：
(1)构建用于表达权利要求1所述截短型丙型肝炎病毒HCVNS3抗原的大肠杆菌优化密
码子，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
(2)将所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：续薇，陈振，杨春云，欧兰香，王岩，江长林，李丽，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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