基因组整合的方法技术

本发明专利技术涉及将一个或多个外源性核酸整合到宿主细胞基因组的一个或多个选定的靶位点中的方法。在一些实施例，所述方法包含使所述宿主细胞基因组接触：一个或多个包含将一个外源性核酸整合到基因组靶位点中的整合多核苷酸，一种能够在所述基因组靶位点引起断裂的核酸酶，和一种线性核酸，所述线性核酸能够自我同源重组、或者能够与同所述细胞群接触的另外一个或多个线性核酸同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状染色体外核酸的形成。在一些实施例，所述方法进一步包含选择表达所述选择标记的宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年12月19日提交的美国临时申请号61/918,625，和2014年2月7日提交的美国临时申请号61/937,444的优先权，所述各临时专利申请通过引用其全部内容并入本文。1.专利
本专利技术所提供的方法和组合物普遍涉及分子生物学和基因工程领域。2.专利技术背景基因工程技术将有针对性的修饰引入宿主细胞基因组，并发现其在各种领域中的用途。根本而言，基因如何影响表型的决心依赖于引入有针对性的插入和缺失从而削弱或废除原生基因功能的能力。在合成生物学领域，能够生产目的化合物的转基因微生物的制造，需要将定制的DNA序列插入到所述宿主细胞染色体中；工业规模生产一般需要将几十种基因例如整个生物合成路径，引入到单一宿主基因组中。在治疗环境中，引入精确的基因组修饰的能力，对于处理由于单基因缺陷所致的疾病具有巨大的潜能，例如伴X染色体的严重联合免疫缺陷(SCID)，血友病B，β-地中海贫血，囊性纤维化，肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血症。最新基因工程进展已经能够操控和/或引入几乎任何基因，从而来处理各种细胞类型和生物体。尤其是，位点特异性设计师核酸酶的出现，通过将靶向断裂引入到宿主细胞基因组中，已经能够进行位点特异性基因修饰，例如基因组编辑。所述这些核酸酶包括锌指核酸酶(ZFNs)，转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)，基于成簇规律间隔短回文重复CRISPR/Cas(CRISPR-相关的)的RNA-引导的核酸内切酶。ZFNs已被使用，尤其已被用于修饰作物中的目标基因位点(Wright et al.,Plant J 44:693-705(2005))，来改善表达治疗抗体的哺乳动物细胞培养株(Malphettes et al.,Biotechnol Bioeng 106(5):774-783(2010))，和编辑人基因组从而引起对HIV的抵抗(Urnov et al.,Nat Rev Genet 11(9):636-646(2010))。同样，TALENs已被用于修饰各种基因组，包括那些作物(Li,et al.,Nat.Biotechnol.30:390–392(2012))、人、牛、和鼠(Xu et al.,Molecular Therapy—Nucleic Acids 2,e112(2013))。最近，CRISPRs已被成功用于编辑细菌基因组(例如Jiang et al.,Nature Biotechnology 31(3):233-239(2013)；Qi et al.,Cell,5,1173–1183(2013)，酵母(例如DiCarlo et al.,Nucleic Acids Res.,7,4336–4343(2013))，斑马鱼(例如Hwang et al.,Nat.Biotechnol.,3,227–229(2013))，果蝇(例如Gratz et al.,Genetics,194,1029–1035(2013))，人细胞(例如Cong et al.,Science 6121,819–823,(2013)；Mali et al.,Science,6121,823–826(2013)；Cho et al.,Nat.Biotechnol.,3,230–232(2013))，和植物(例如Jiang et al.,Nucleic Acids Research 41(20):e188(2013))；Belhaj et al.,Plant Methods 9(39)(2013))。位点特异性核酸酶诱导染色体DNA断裂将刺激所述宿主细胞的细胞DNA修复机制，包括非同源末端连接(NHEJ)，单链退火(SSA)，和定向同源修复(HDR)。核酸酶诱导的双链断裂的NHEJ-介导的修复导致在所述靶位点引入小缺失或插入，导致基因功能的损伤或废除，如通过移码突变。相同分子的断裂端通过不涉及另一DNA分子的多步酶促过程，从而再次连接。NHEJ容易出错且不精确，将在修复期间，在断裂位点，与可变大小的不同和不可预知的插入和缺失产生突变体等位基因。同样地，当来自DSB侧翼重复序列的互补链互相退火时，SSA将发生，并导致DSB修复但间插序列的缺失。相反，HDR通常会导致一个准确修复的分子，因其依赖于一个独立的未损坏的具有同源序列的分子来帮助修复所述断裂。原产自所述细胞的同源供体序列主要有两种来源：同源染色体，可在整个细胞周期获得，和所述断裂分子的姐妹染色单体(其仅可在DNA复制后获得)。然而，基因组工程技术通常引入包括与所述DSB靶位点同源并可与所述靶位点重组的区域的外源性供体DNAs。通过包括在外源性供体内，得到所述目标序列的修饰，这些修饰通过HDR可以被整合到所述原始目标序列中，或替代所述原始目标序列。根据核酸酶诱导的DNA断裂，所述宿主细胞修复路径的选择取决于多种因素，并且所述结果可以指示所需基因组修饰的精度。所述因素包括所述宿主细胞的DNA破坏响应路径，断裂的本质，染色质重塑，特异性修复蛋白的转录，和出现在所述细胞周期后期阶段的周期蛋白依赖性激酶活性。参见如Beucher et al.,EMBO J 28:3413-27(2009)；et al.,Nat Cell Biol 7:195-201(2005)；Jazayeri et al.,Nat Cell Biol 8:37-45(2006)；Huertas et al.,Nature 455:689-92(2008)；Moyal et al.,Mol Cell 41:529-42(2011)；和Chernikova et al.,Radiat Res174:558-65(2010)。如果供体DNA对裂解DNA具有强同源性，那么通过同源重组，所述供体整合的机会将会显著增加。参见如Moehle et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,9:3055–3060(2007)；Chen et al.,Nat.Methods,9,753–755(2011)。然而，同源供体DNA通过HDR整合到分裂靶位点中的总体频率，与通过NHEJ所述靶位点的非整合修复相比，仍然可以很低。最近研究表明HDR-介导的编辑通常是一个低效率事件，且越少精确的NHEJ可以主导DSBs修复的机制。譬如Mali等人(Science 339:823-826(2013))试图使用CRISPR(向导RNA和Cas9核酸内切酶)和同时提供单链供体DNA，在人K562细胞内进行基因修饰，并观测到在AAVS1位点HDR-介导的基因修饰频率为2.0％，然而，NHEJ-介导的靶向突变发生在相同位点观测到频率为38％。Li等人(Nat Biotechnol.(8):688-91(2013))试图使用CRISPR(向导RNA和Cas9核酸内切酶)和同时提供双链供体DNA，在植物本氏烟中进行基因置换，并观测到HDR-介导的基因置换频率为9.0％，然而，NHEJ-介导的靶向突变发生观测到频率为14.2％。Kass等人(Proc Natl Acad Sci U S A.110(14):5564–5569(2013))对在源于不同血统的原代正常体细胞类型中的HDR进行了研究，并观测到鼠胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择有能力同源重组的宿主细胞的方法，包括：(a)使一个或多个宿主细胞与一种线性核酸接触，所述线性核酸能够自我同源重组、或者能够与同所述细胞群接触的另外一个或多个线性核酸同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状染色体外核酸的形成；和(b)选择一种表达所述选择标记的宿主细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.19 US 61/918,625;2014.02.07 US 61/937,4441.一种选择有能力同源重组的宿主细胞的方法，包括：(a)使一个或多个宿主细胞与一种线性核酸接触，所述线性核酸能够自我同源重组、或者能够与同所述细胞群接触的另外一个或多个线性核酸同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状染色体外核酸的形成；和(b)选择一种表达所述选择标记的宿主细胞。2.一种将外源性核酸整合到宿主细胞基因组靶位点中的方法，所述方法包括：(a)使一个或多个宿主细胞接触：(i)一种外源性核酸(ES)，所述外源性核酸(ES)通过同源重组，能够重组在所述宿主细胞基因组的所述靶位点(TS)；(ii)一种能够在TS产生断裂的核酸酶(N)；和(iii)一种线性核酸，所述线性核酸能够自我同源重组、或者能够与同所述宿主细胞接触的另外一个或多个线性核酸同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状染色体外核酸的形成；和(b)选择一种表达所述选择标记的宿主细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述线性核酸包含能够互相同源重组的两个内部同源区域，于是所述内部同源区域的同源重组导致的结果是表达所述选择标记的所述环状染色体外核酸的形成。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述线性核酸包含一个同源区域，所述同源区域能够与同所述宿主细胞接触的另一个线性核酸的同源区域重组，于是所述两个线性核酸的同源重组导致的结果是表达所述选择标记的所述环状染色体外核酸的形成。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中，所述线性核酸包含所述选择标记的一个部分的、中断的、和/或不连续的编码序列，其中，所述选择标记不能从所述线性核酸进行表达，于是所述环状染色体外核酸的所述形成导致的结果是所述选择标记的一个完整编码序列的形成，其中所述选择标记可以从所述环状染色体外核酸进行表达。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中，所述接触的宿主细胞是在所述选择之前培养至少约12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或多于72小时的一段时间。7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中，所述接触的细胞是在选择对所述存活细胞不表达所述选择标记的培养条件下进行培养。8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中步骤(b)中所述的选择包括通过视觉、比色或荧光检测方法来检测所述选择标记的所述表达。9.根据权利要求2至8任一项所述的方法，其进一步包括恢复宿主细胞的步骤，其中，ES已经在TS同源重组。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述恢复不需要将选择标记整合到所述宿主细胞基因组中。11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述恢复以至少约每10、9、8、7、6、5、4、3、或2的发生频率中的一个接触宿主细胞或其克隆群进行筛选。12.根据权利要求2至11任一项所述的方法，其进一步包括从所述选定的宿主细胞中消除所述环状染色体外核酸的步骤。13.根据权利要求2至12任一项所述的方法，其中，多个(n)外源性核酸被整合到所述宿主细胞基因组的多个(n)靶位点中，其中n至少为2，其中，步骤(a)包括使所述宿主细胞接触：(i)所述多个外源性核酸，其中x是从1到n的不同整数，并且对于每个整数x，每个外源性核酸(ES)x通过同源重组能够重组在一个靶位点(TS)x，所述靶位点(TS)x选自所述宿主细胞基因组的所述多个(n)靶位点；(ii)对于每个所述靶位点(TS)x，一个能够在(TS)x产生断裂的核酸酶(N)x。14.根据权利要求13所述的方法，其中，单一核酸酶能够分裂每个(TS)x。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，n＝3、4、5、6、7、8、9或10。16.根据权利要求2至15任一项所述的方法，其中，ES包含第一同源区(HR1)和第二同源区(HR2)，其中HR1和HR2通过同源重组，能够分别与第三同源区(HR3)和第四同源区(HR4)进行重组，其中HR3和HR4各自在TS处。17.根据权利要求2至16任一项所述的方法，其中，N能够在TS产生单链断裂或双链断裂。18.根据权利要求2至17任一项所述的方法，其中，ES进一步包含一种目的核酸D。19.根据权利要求18所述的方法，其中，D是选自由选择标记，启动子，编码表位标记的核酸序列，目的基因，报告基因，和编码终止密码子的核酸序列组成的组。20.根据权利要求2至19任一项所述的方法，其中，ES是线性的。21.根据权利要求2至20任一项所述的方法，其中，所述环状染色体外核酸进一步包含所述核酸酶的编码序列。22.根据权利要求2至21任一项所述的方法，其中，所述核酸酶是RNA-引导的DNA核酸内切酶。23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述RNA-引导的DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述环状染色体外核酸进一步包含一个序列，所述序列编码crRNA活性和tracrRNA活性，并通过所述RNA-引导的DNA核酸内切酶能够位点特异性识别和分裂TS。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述crRNA活性和所述tracrRNA活性均表示为一个单一连续的RNA分子。26.根据权利要求2至21任一项所述的方法，其中，所述核酸酶是选自由核酸内切酶，锌指核酸酶，TAL-效应因子DNA结合结构域-核酸酶融合蛋白(TALEN)，转座酶，和位点特异性重组酶组成的组。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述锌指核酸酶是一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与一个工程化锌指结合结构域融合的IIS型限制性核酸内切酶的分裂结构域。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述IIS型限制性核酸内切酶是选自由HO核酸内切酶和Fok I核酸内切酶组成的组。29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述锌指结合结构域包含3、5或6个锌指。30.根据权利要求26所述的方法，其中，所述核酸内切酶是一种归巢核酸内切酶，所述归巢核酸内切酶是选自由LAGLIDADG归巢核酸内切酶，HNH归巢核酸内切酶，His-Cys箱归巢核酸内切酶，GIY-YIG归巢核酸内切酶，和蓝藻归巢核酸内切酶组成的组。31.根据权利要求26所述的方法，其中，所述核酸内切酶是选自由H-DreI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、Pi-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-CphI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp68031、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、i-UarAP、i-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MgaI、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、或PI-TliII组成的组。32.根据权利要求26所述的方法，其中，所述核酸内切酶是通过修饰而特异性地结合一个内源性基因组序列，其中所述修饰的核酸内切酶不再结合其野生型核酸内切酶识别序列。33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述修饰的核酸内切酶是衍生自一种归巢核酸内切酶，所述归巢核酸内切酶是选自由LAGLIDADG归巢核酸内切酶，HNH归巢核酸内切酶，His-Cys箱归巢核酸内切酶，GIY-YIG归巢核酸内切酶，和蓝藻归巢核酸内切酶组成的组。34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述修饰的核酸内切酶是衍生自一种核酸内切酶，所述核酸内切酶是选自由H-DreI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、Pi-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-CphI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp68031、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、i-UarAP、i-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MgaI、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、或PI-TliII组成的组。35.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是原核细胞。36.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是真核细胞。37.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是选自由真菌细胞、细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、鸟细胞、鱼细胞和哺乳动物细胞组成的组。38.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞是选自由啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞组成的组。39.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是人细胞。40.根据权利要求1至34任一项所述的方法，其中，所述宿主细胞是酵母细胞。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。42.一种宿主细胞，包含：(i)一种外源性核酸(ES)，所述外源性核酸(ES)通过同源重组能够重组在所述宿主细胞基因组的靶位点(TS)；(ii)一种能够在TS产生断裂的核酸酶(N)；和(iii)一种线性核酸，所述线性核酸能够自我同源重组、或者能够与所述宿主细胞内的另外一个或多个线性核酸同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状染色体外核酸的形成。43.根据权利要求42所述的宿主细胞，其中，所述线性核酸包含能够互相同源重组的两个内部同源区域，于是所述内部同源区域的同源重组导致的结果是表达所述选择标记的所述环状染色体外核酸的形成。44.根据权利要求42所述的宿主细胞，其中，所述线性核酸包含一个同源区域，所述同源区域能够与所述宿主细胞内的另一个线性核酸的同源区域重组，于是所述两个线性核酸的同源重组导致的结果是表达所述选择标记的所述环状染色体外核酸的形成。45.根据权利要求42至44任一项所述的宿主细胞，其中，所述线性核酸包含所述选择标记的一个部分的、中断的、和/或不连续的编码序列，其中所述选择标记不能从所述线性核酸进行表达，于是所述环状染色体外核酸的所述形成导致的结果是所述选择标记的一个完整编码序列的形成，其中，所述选择标记可以从所述环状染色体外核酸进行表达。46.根据权利要求42至45任一项所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含：(i)多个外源性核酸，其中x是从1到n的不同整数，并且对于每个整数x，每个外源性核酸(ES)x通过同源重组能够重组在一个靶位点(TS)x，所述靶位点(TS)x选自所述宿主细胞基因组的所述多个(n)靶位点；(ii)对于每个所述靶位点(TS)x，一个能够在(TS)x产生断裂的核酸酶(N)x。47.根据权利要求42至46任一项所述的宿主细胞，其中，ES包含第一同源区(HR1)和第二同源区(HR2)，其中HR1和HR2通过同源重组，能够分别与第三同源区(HR3)和第四同源区(HR4)进行重组，其中HR3和HR4各自在TS处。48.根据权利要求42至41任一项所述的宿主细胞，其中，N能够在TS产生单链断裂或双链断裂。49.根据权利要求42至48任一项所述的宿主细胞，其中，ES进一步包含一种目的核酸D。50.根据权利要求49所述的宿主细胞，其中，D是选自由选择标记，启动子，编码表位标记的核酸序列，目的基因，报告基因，和编码终止密码子的核酸序列组成的组。51.根据权利要求42至50任一项所述的宿主细胞，其中，ES是线性的。52.根据权利要求42至51任一项所述的宿主细胞，其中，所述环状染色体外核酸进一步包含所述核酸酶的编码序列。53.根据权利要求42至52任一项所述的宿主细胞，其中，所述核酸酶是RNA-引导的DNA核酸内切酶。54.根据权利要求53所述的宿主细胞，其中，所述RNA-引导的DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。55.根据权利要求53或54所述的宿主细胞，其中，所述环状染色体外核酸进一步包含一个序列，所述序列编码crRNA活性和tracrRNA活性，并通过所述RNA-引导的DNA核酸内切酶能够位点特异性识别和分裂TS。56.根据权利要求55所述的宿主细胞，其中，所述crRNA活性和tracrRNA活性均表示为一个单一连续的RNA分子。57.根据权利要求42至56任一项所述的宿主细胞，其中，所述核酸酶是选自由核酸内切酶，锌指核酸酶，TAL-效应因子DNA结合结构域-核酸酶融合蛋白(TALEN)，转座酶，和位点特异性重组酶组成的组。58.根据权利要求57所述的宿主细胞，其中，所述锌指核酸酶是一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与一种工程化锌指结合结构域融合的IIS型限制性核酸内切酶的分裂结构域。59.根据权利要求58所述的宿主细胞，其中，所述IIS型限制性核酸内切酶是选自由HO核酸内切酶和Fok I核酸内切酶组成的组。60.根据权利要求58所述的宿主细胞，其中，所述锌指结合结构域包含3、5或6个锌指。61.根据权利要求58所述的宿主细胞，其中，所述核酸内切酶是一种归巢核酸内切酶，所述归巢核酸内切酶是选自由LAGLIDADG归巢核酸内切酶，HNH归巢核酸内切酶，His-Cys箱归巢核酸内切酶，GIY-YIG归巢核酸内切酶，和蓝藻归巢核酸内切酶组成的组。62.根据权利要求58所述的宿主细胞，其中，所述核酸内切酶是选自由H-DreI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、Pi-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-CphI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp68031、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、i-UarAP、i-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MgaI、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、或PI-TliII组成的组。63.根据权利要求58所述的宿主细胞，其中，所述核酸内切酶是通过修饰而特异性地结合一个内源性基因组序列，其中所述修饰的核酸内切酶不再结合其野生型核酸内切酶识别序列。64.根据权利要求63所述的宿主细胞，其中，所述修饰的核酸内切酶是衍生自一种归巢核酸内切酶，所述归巢核酸内切酶是选自由LAGLIDADG归巢核酸内切酶，HNH归巢核酸内切酶，His-Cys箱归巢核酸内切酶，GIY-YIG归巢核酸内切酶，和蓝藻归巢核酸内切酶组成的组。65.根据权利要求63所述的宿主细胞，其中，所述修饰的核酸内切酶是衍生自一种核酸内切酶，所述核酸内切酶是选自由H-DreI、I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、Pi-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-CphI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp68031、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、i-UarAP、i-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MgaI、PI-MtuI、PI-MtuHIPPI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、或PI-TliII组成的组。66.一种组合物，包含：(a)一种位点特异性核酸酶，或一种包含位点特异性核酸酶的编码序列的核酸；和(b)一种包含两个内部同源区域的线性核酸，所述两个内部同源区域能够在宿主细胞内互相同源重组，于是所述内部同源区域的同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状核酸的形成。67.根据权利要求66所述的组合物，其中，所述线性核酸包含所述选择标记的一个部分的、中断的、和/或不连续的编码序列，其中，所述选择标记不能从宿主细胞内的所述线性核酸进行表达，于是所述环状核酸的所述形成导致的结果是所述选择标记的一个完整编码序列的形成，其中，所述选择标记可以从宿主细胞内的所述环状核酸进行表达。68.一种组合物，包含：(a)一种位点特异性核酸酶，或一种包含位点特异性核酸酶的编码序列的核酸；和(b)一种第一线性核酸和另外的一个或多个线性核酸，其中，所述第一和第二线性核酸能够在宿主细胞内互相同源重组，于是所述同源重组导致的结果是含有一个用于选择标记的编码序列的环状核酸的形成。69.根据权利要求68所述的组合物，其中，每个线性核酸包含所述选择标记的一个部分的、中断的、和/或不连续的编码序列，其中，所述选择标记不能从宿主细胞内的每个线性核酸进行表达，于是所述环状核酸的所述形成导致的结果是所述选择标记的一个完整编码序列的形成，其中，所述选择标记可以从宿主细胞内的所述环状核酸进行表达。70.根据权利要求66至69任一项所述的组合物，其中，所述环状核酸进一步包含一个位点特异性核酸酶的编码序列。71.根据权利要求66至70任一项所述的组合物，其中，所述位点特异性核酸酶是RNA-引导的DNA核酸内切酶。72.根据权利要求71所述的组合物，其中，所述RNA-引导的DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。73.根据权利要求71或72所述的组合物，其进一步包括：(i)一种包含crRNA活性的核糖核酸和一种包含tracrRNA活性的核糖核酸；或(ii)一种编码包含crRNA活性的核糖核酸的脱氧核糖核酸和一种编码包含tracrRNA活性的核糖核酸的脱氧核糖核酸。74.根据权利要求72或73所述的组合物，其中，所述环状核酸进一步包含一种编码包含crRNA活性的核糖核酸的脱氧核糖核酸，和一种编码包含tracrRNA活性的核糖核酸的脱氧核糖核酸。75.根据权利要求73或74所述的组合物，其中编码所述crRNA活性和所述tracrRNA活性的所述脱氧核糖核酸是在一个单一连续的RNA分子上编码所述活性。76.根据权利要求66至70任一项所述的组合物，其中，所述位点特异性核酸酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·霍维茨，克里斯蒂·米歇尔·霍金斯，马克斯·舒伯特，韦恩·司徒，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US