一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒，其特征在于，含有重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒的构建过程依次是：（1）鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物的设置过程：（2）鸭β-防御素-2基因片段的PCR扩增过程：重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建。本发明专利技术与已有技术相比，具有抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高的优点。
Recombinant plasmid containing synthetic duck beta defensin -2 gene
A recombinant plasmid containing synthetic recombinant avian beta defensin -2 gene, which is characterized in that the construction process of recombinant plasmid containing the recombinant avian beta defensin -2 gene were: (1) setting process of avian beta defensin -2 gene upstream primer and downstream primer: (2) the amplification process of duck anti beta defensin -2 gene fragment PCR: recombinant plasmid pPICZ alpha -A-AvBD2. Compared with the prior art, the invention has the antibacterial and growth promoting activity, is suitable for being used in the animal husbandry production, and has the advantages of low production cost and high production efficiency.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种动物生物医药工程领域的基因的重组质粒。
技术介绍
现代畜牧业饲用动物在具有高产性能的同时，对环境应激和病原愈加敏感。特别是在集约化饲养条件下，饲用动物面临更多的应激和病原的侵袭。畜牧生产中迫切需要一种高效、无毒害、无残留的免疫促进剂和生长促进剂，在提高饲用动物抗病力的同时，又能提高饲用动物的生产性能及动物产品的安全，以促进畜牧业的健康发展，降低畜牧生产对人类健康及生态环境的破坏。前人研究发现，防御素具有广谱杀菌活性以及超强的抗微生物作用，且作用机理特殊，微生物不易产生抗性，对肿瘤细胞还有细胞毒性作用，同时也可以作为免疫增强剂用于调节动物机体免疫系统，给人们展现了一条开发理想促生长及免疫促进的新途径。由于动物体天然防御素含量低，直接提取远不能满足需要，且成本高、得率低、工序繁；化学合成可行但成本太高 ，应用受到局限；随着基因工程技术的发展，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为可能。目前，防御素的基因工程已是生物医学领域研究的热点。基于防御素的重要生理功能及其在生产实际中具有非常好的应用前景，我们进行了一种重组鸭β -防御素-2蛋白体外重组表达生产方法的专利技术研究。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高的含有合成的重组鸭β -防御素-2基因的重组质粒。本专利技术重组鸭防御素-2基因是这样实现的，依次包括鸭防御素-2(AvBD2)基因核苷酸序列设计与体外合成、重组质粒pPICZ a -A-AvBD2的构建过程、含鸭β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重组转化子的筛选过程、含鸭β-防御素-2 (AvBD2)的酵母重组转化子体外诱导表达过程， 本专利技术的鸭β_防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列设计与体外合成过程是这样实现的， 参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成(送上海生工生物工程技术有限公司进行基因合成)，改造后合成的鸭防御素-2 (AvBD2)基因核苷酸序列如下:GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTM。本专利技术的含有重组鸭β -防御素-2基因的重组质粒pPICZ a _A_AvBD2是这样实现的， 重组质粒pPICZ a -A-AvBD2的构建过程依次是:1、鸭β-防御素-2(AvBD2)基因上游引物、下游引物的设置过程:根据合成的鸭β-防御素_2(AvBD2)基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZ a -A上的酶切位点，上游引物设计时添加了通ο I酶切位点及Kex2与Stel3蛋白酶裂解位点，在ZAo I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT ;下游引物设计在基因末端，并加上Not I酶切位点，在Afoi I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β_防御素-2 (AvBD2)基因上游引物、下游引物分别为， 鸭β -防御素-2 (AvBD2)基因上游引物: 5’ -TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3> Xho I 酶切位点， 鸭β -防御素-2 (AvBD2)基因下游引物: 5’ -GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3，Not I 酶切位点， 2、鸭防御素-2(AvBD2)基因片段的PCR扩增过程:以合成的鸭β-防御素_2(AvBD2)基因为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素_2 (AvBD2)上/下游引物、dNTPs 进行扩增反应，PCR 的反应体系为:10XPCR Buffer(包含 0.5mmol/L MgC12, 50mmol/L KCl, lOmmol/L Tris (三羟甲基氨基甲烷)*HC1，0.001% 明胶)5 μ L, 4X dNTPs (包含 dATP(三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸)、dTTP (三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸)、dCTP (三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸)和dGTP (三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸)各2.5mmol/L) 4 μ L，浓度均为20 μ mol/L的鸭防御素-2 (AvBD2)上、下游引物各lyL，模板为合成的鸭β -防御素_2 (AvBD2)基因I μ L，ddH20 (双蒸水)37.5 μ L，浓度为5 μ mol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5 μ L，反应过程依次为:a、94°C处理3min ;b、依次94°C处理30s、56°C处理30s、72°C处理30s ;反应过程进行30个循环；c、72°C延伸IOmin ;即获得鸭β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR产物，鸭β -防御素_2(AvBD2)基因的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见大小约130bp的扩增条带，与预期的结果一致。3、重组质粒 pPICZ a -A_AvBD2的构建:将过程2的鸭β -防御素_2 (AvBD2)基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE包含有IOmmoI/L Tris *HC1, lmmol/L EDTA(乙二胺四乙酸))溶解，TE 溶解物用I 进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZ a-A质粒进行双酶切处理，胶回收大小约3.6kb的DNA片段，分别取5 μ L双酶切后胶回收的鸭β -防御素_2(AvBD2)基因片段和3 μ L双酶切后胶回收的pPICZ a-A质粒，加入IyL的10ΧΤ4 DNA连接Buffer(10XT4 DNA 连接 Buffer 包含有 0.5mol/L Tris.HCl，0.lmol/L MgCl2, 50mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，5mmol/L DATP,0.25mg/mL BSA (牛血清白蛋白))，I μ L Τ4 DNA连接酶，在16°C下连接处理18小时，将连接产物转化Top 10感受态细胞，在含有25 μ g/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37°C培养过夜，即完成重组质粒pPICZ a _A_AvBD2的构建。培养板上长出来的白色菌落即为含有重组质粒pPICZ a -A-AvBD2的阳性菌。pPICZ a -A质粒为Invitrogen公司的产品。不呢专利技术的重组鸭β -防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法是这样实现的， 1、重组质粒的制备和线性化:挑取转化入重组质粒pPICZ a -A-AvBD2的Top 10阳性菌接种于25 mL含25 μ g/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37°C，220 rpm振摇培养24 h。将菌液于4°C，5 OOOrpm离心10 min，沉淀细菌。然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒。用Sac I酶将抽提的重组质粒pPICZ a _A_AvBD2线性化。2、毕赤酵母电转化感受态细胞的制备:接种毕赤酵母本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有合成的重组鸭β?防御素?2基因的重组质粒，其特征在于，含有重组鸭β?防御素?2基因的重组质粒的构建过程依次是：（1）鸭β?防御素?2基因上游引物、下游引物的设置过程：根据合成的鸭β?防御素?2基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZα?A上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xho?I酶切位点及Kex2与Ste13蛋白酶裂解位点，在Xho?I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT；下游引物设计在基因末端，并加上Not?I酶切位点，在Not?I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β?防御素?2基因上游引物、下游引物分别为，鸭β?防御素?2基因上游引物：5’?TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG?3’Xho?I酶切位点?，鸭β?防御素?2基因下游引物：5’?GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT?3’?Not?I酶切位点?，（2）鸭β?防御素?2基因片段的PCR扩增过程：以合成的鸭β?防御素?2基因为模板，加入ExTaq?DNA聚合酶、鸭β?防御素?2上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR?Buffer5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸭β?防御素?2上、下游引物各1μL，模板为合成的鸭β?防御素?2基因1μL，ddH2O37.5μL，浓度为5μmol/L的?ExTaq?DNA聚合酶0.5μL，10×PCR?Buffer包含0.5mmol/L?MgCl2、50mmol/L?KCl、10mmol/L?Tris·HCl、0.001wt%明胶，4×dNTPs包含用量均为2.5mmol/L?的dATP、?dTTP、?dCTP、?dGTP，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸭β?防御素?2基因的PCR产物，?（3）重组质粒pPICZα?A?AvBD2的构建：将过程（2）的鸭β?防御素?2基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有10mmol/L?Tris·HCl、1mmol/L?EDTA?，TE溶解物用XohI、Not?I进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZα?A质粒进行双酶切处理，胶回收大小为3.6kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭β?防御素?2基因片段和3μL双酶切后胶回收的pPICZα?A质粒，加入1μL?的10×T4?DNA连接Buffer，1μL?T4?DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化Top?10感受态细胞，在含有25μg/mL?Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37℃培养过夜，即完成重组质粒pPICZα?A?AvBD2的构建，形成转化入重组质粒pPICZα?A?AvBD2的Top?10阳性菌，10×T4?DNA连接Buffer包含有?0.5mol/L?Tris·HCl、?0.1mol/L?MgCl2、?50mmol/L?DTT、5mmol/L?DATP。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张辉华，韩小凤，马保华，毕英佐，马静云，谢青梅，李辰，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。