外源性基因表达增强剂制造技术

本发明专利技术的课题在于开发并提供简便且有效抑制作为绢丝腺特异性主要蛋白质的丝胶蛋白和/或丝素蛋白H链的基因表达，以在基因重组家蚕中利用绢丝腺高效生产目标蛋白质作为蛋白质的大量生产系统的方法。本发明专利技术提供能够在家蚕体内表达反义RNA的家蚕系统，上述反义RNA将丝胶蛋白和/或丝素蛋白H链的重复序列区域作为靶部位。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种在利用了家蚕绢丝腺的蛋白质表达系统中将反义RNA表达载体作为有效成分的外源性基因表达增强剂，和具有该反义RNA表达载体的基因重组家蚕。
技术介绍
家蚕(Bombyxmori)的绢丝腺，具有短时间合成大量蛋白质的能力。另外，由于家蚕的绢丝腺是大型器官所以容易摘出，合成的蛋白质被保存于绢丝腺内腔，所以也具有容易回收的优点。因此，利用绢丝腺表达目标蛋白质的基因重组家蚕，被视为有希望作为有用蛋白质或高性能丝等附加值高的蛋白质的大量生产系统。家蚕绢丝腺，形态学上是如图1所示的左右1对的器官，分别由前部绢丝腺、中部绢丝腺和后部绢丝腺3个区域构成。在中部绢丝腺细胞内，合成作为绢丝的覆盖成分的水溶性的明胶样蛋白质、丝胶蛋白1(本说明书中，常常简称为“Ser1”)、丝胶蛋白2(本说明书中，常常简称为“Ser2”)和丝胶蛋白3(本说明书中，常常简称为“Ser3”)(图1)。这些蛋白质，在合成后被分泌至中部绢丝腺内腔中。另外，在后部绢丝腺细胞内，合成构成属于绢丝纤维成分的丝素蛋白的3个主要蛋白质即丝素蛋白H链(本说明书中，常常简称为“FibH”)、丝素蛋白L链(本说明书中，常常简称为“FibL”)和p25/FHX(以下，记为“p25”)。这3个蛋白质以FibH：FibL：p25＝6:6:1的比率形成复合物(silkfibroinelementaryunit；本说明书中，以下称为“SFEU复合物”)，分泌至后部绢丝腺内腔中。然后，SFEU复合物转移至中部绢丝腺内腔，被丝胶蛋白覆盖，作为绢丝从前部绢丝腺吐丝(图1：非专利文献1)。因此，将家蚕绢丝腺作为蛋白质表达系统利用时，利用中部绢丝腺或后部绢丝腺中特异性表达的基因表达系统即可。实际上，目前为止作为使用中部绢丝腺的重组蛋白质表达系统，确立了利用GAL4/UAS系统(非专利文献2)或将Ser1启动子和Hr3增强子进行组合的系统的大量表达方法(非专利文献3)。在利用家蚕绢丝腺的蛋白质表达系统中，为了提高目标蛋白质的生产效率，提高该基因的表达量本身、通过减少绢丝腺的其他主要蛋白质量从而使目标蛋白质的表达量相对上升以及从家蚕有效回收目标蛋白质是重要的。阻碍蛋白质回收的原因之一，可举出夹杂蛋白质的存在。例如，可举出作为绢丝腺的主要蛋白质的丝素蛋白、丝胶蛋白。这些蛋白质由于合成量多，且是纤维品质，粘稠性、结晶性高，因此容易成为目标蛋白质提取或精制时堵塞柱或过滤器的原因。因此，对于蛋白质的有效回收，需要抑制这些夹杂蛋白质的基因表达。另一方面，家蚕绢丝腺中表达的这些基因的过度的表达抑制，由于会对家蚕的生长本身产生影响，因此需要控制该表达抑制的技术。家蚕绢丝腺中，抑制内源性丝素蛋白或丝胶蛋白的表达的方法中，包括使用已有的基因突变系统的方法和人为抑制这些基因的表达的方法。作为使用已有的基因突变系统的方法的例子，已知在家蚕中由后部绢丝腺表达的FibH链具有异常的Nd系统、FibL链具有异常的Nd-s系统和Nd-sD系统。由于Nd系统中FibH链的表达或者Nd-s系统和Nd-sD系统中FibL链的表达非常低，因此通过使用这些系统利用中部绢丝腺使目标蛋白质表达能够提高其表达量(专利文献1)。但是，上述基因突变系统，不能抑制由中部绢丝腺表达的Ser1等基因表达，另外，由家蚕的中部绢丝腺表达的基因的突变系统等目前为止没有报告。作为人为抑制基因的表达的方法的例子，可举出RNAi(RNAinteference)法。RNAi法是在生物体内介由靶基因的转录产物的分解，抑制(沉默)该基因的表达的方法。通常在RNAi法中，使用由双链RNA构成的siRNA(smallinterferingRNA)或miRNA(microRNA)以及由单链RNA构成通过自折叠(self-folding)在分子内形成双链RNA区域的shRNA(shorthairpinRNA)等RNAi分子。另一方面，由单链RNA构成且不形成分子内双链RNA区域的反义RNA(本说明书中，常常记为“asRNA”)与靶mRNA退火，最终经过与双链RNA相同过程发挥RNAi所致的基因的表达抑制效果。但是，由于与其他RNAi分子相比其效果非常低，因此基本没有使用(非专利文献4)。在以家蚕为首的鳞翅目(Lepidoptera)昆虫中，与其他生物种相比RNAi所致的基因表达抑制的效果通常低(非专利文献5)。但是，已知其效果因组织不同而不同，即使是鳞翅目，也只是在皮肤或绢丝腺中比较高。例如，报告通过使FibH链、FibL链和Ser1的双链RNA在家蚕的细胞内表达，能够抑制各基因的表达(专利文献2～4)。但是，这些方法，由于必须在生物体内表达和构筑双链RNA，而且表达载体的制作或基因重组家蚕制作的工序复杂需要劳力，因此存在制造成本变高的问题。而且，在以往技术中，存在组合多个基因而同时抑制其表达非常困难的问题。这些问题，如果是由单链RNA构成的asRNA则能够克服。但是，报告了在家蚕绢丝腺内asRNA所致的基因表达抑制的效果也非常低，与双链RNA相比仅为数百分之一左右(非专利文献6)。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2004-135528专利文献2:日本特表2006-521802专利文献3:日本特开2008-245623专利文献4:日本特开2011-103816非专利文献非专利文献1:InoueS.etal.,2000,TheJournalofBiologicalChemistry,275(51):40517-40528.非专利文献2:TatematsuK.etal.,2010,TransgenicResearch,19(3):473-87.非专利文献3:TomitaM.etal.,2007,TransgenicResearch,16(4):449-465.非专利文献4:TavernarakisN.etal.,2000,Naturegenetics,24180-183.非专利文献5:TereniusO.etal.,2011,JournalofInsectPhysiology,(57):231-245非专利文献6:IsobeR.etal.,2002,Journalofinsectbiotechnologyandsericology,71,43-47
技术实现思路
本专利技术的课题在于开发并提供有效抑制作为绢丝腺内源性的主要的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕绢丝腺的外源性基因表达增强剂，其特征在于，含有能够使家蚕中部绢丝腺特异性表达选自丝胶蛋白1反义RNA、丝胶蛋白2反义RNA和丝胶蛋白3反义RNA中的至少一个反义RNA的反义RNA表达载体和/或能够使家蚕后部绢丝腺特异性表达丝素蛋白H链反义RNA的反义RNA表达载体作为有效成分，其中，所述丝胶蛋白1反义RNA含有与编码序列编号1所示的家蚕丝胶蛋白1的氨基酸序列中628位～1054位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，所述丝胶蛋白2反义RNA含有与编码序列编号4所示的家蚕丝胶蛋白2的氨基酸序列中41位～117位或685位～1359位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，所述丝胶蛋白3反义RNA含有与编码序列编号8所示的家蚕丝胶蛋白3的氨基酸序列中141位～978位和1031位～1178位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，所述丝素蛋白H链反义RNA含有与编码序列编号12所示的家蚕丝素蛋白H链的氨基酸序列中152位～5203位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.25 JP 2013-2221381.一种家蚕绢丝腺的外源性基因表达增强剂，其特征在于，含有
能够使家蚕中部绢丝腺特异性表达选自丝胶蛋白1反义RNA、丝胶蛋
白2反义RNA和丝胶蛋白3反义RNA中的至少一个反义RNA的反义
RNA表达载体和/或能够使家蚕后部绢丝腺特异性表达丝素蛋白H链
反义RNA的反义RNA表达载体作为有效成分，其中，
所述丝胶蛋白1反义RNA含有与编码序列编号1所示的家蚕丝胶
蛋白1的氨基酸序列中628位～1054位的重复序列区域的至少一个重复
单元的碱基序列互补的序列，
所述丝胶蛋白2反义RNA含有与编码序列编号4所示的家蚕丝胶
蛋白2的氨基酸序列中41位～117位或685位～1359位的重复序列区
域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，
所述丝胶蛋白3反义RNA含有与编码序列编号8所示的家蚕丝胶
蛋白3的氨基酸序列中141位～978位和1031位～1178位的重复序列
区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，
所述丝素蛋白H链反义RNA含有与编码序列编号12所示的家蚕
丝素蛋白H链的氨基酸序列中152位～5203位的重复序列区域的至少
一个重复单元的碱基序列互补的序列。
2.根据权利要求1所述的外源性基因表达增强剂，其中，丝胶蛋
白1的重复单元由序列编号2所示的氨基酸序列构成，
丝胶蛋白2的重复单元由序列编号5或6所示的氨基酸序列构成，
丝胶蛋白3的重复单元由序列编号9或10所示的氨基酸序列构成，
另外
丝素蛋白H链的重复单元由序列编号13所示的氨基酸序列构成。
3.根据权利要求1所述的外源性基因表达增强剂，其中，
丝胶蛋白1反义RNA由序列编号3所示的碱基序列构成，
丝胶蛋白2反义RNA由序列编号7所示的碱基序列构成，
丝胶蛋白3反义RNA由序列编号11所示的碱基序列构成，另外
丝素蛋白H链反义RNA由序列编号14所示的碱基序列构成。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的外源性基因表达增强剂，其
中，所述反义RNA表达载体由2个亚单元构成。
5.一种基因重组家蚕，其特征在于，具有能够使家蚕中部绢丝腺
特异性表达选自丝胶蛋白1反义RNA、丝胶蛋白2反义RNA和丝胶蛋
白3反义R...

【专利技术属性】
技术研发人员：立松谦一郎，濑筒秀树，内野惠郎，小岛桂，
申请(专利权)人：国立研究开发法人农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP