一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法技术

本发明专利技术公开了一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点，根据马铃薯质体基因组全序列资料设计合成引物，PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因区段。将所扩增的约2.7kb的片段进行序列测定及同源性比较，将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建马铃薯质体定点转化载体pBGLIA-GFP。通过基因枪轰击，该载体在马铃薯块茎中瞬时表达GFP蛋白，验证外源蛋白的表达特性，为进一步将利用马铃薯等作物器官作为生物反应器来表达外源蛋白快速生产药用蛋白，生物抗体等奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体设及一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋 白方法。
技术介绍
植物生物反应器与复杂并昂贵的细胞培养为基础的表达系统相比，具有安全、廉 价和可大规模生产等优点。植物生物反应器的问世，为生产可食疫苗、药用蛋白和提高植物 营养价值带来了希望。然而，传统的细胞核转基因植物存在着外源基因表达效率低、环境安 全性差和后代不稳定等缺点，促使人们不得不致力于寻找一条新的途径。W质体转基因植 物作为生物反应器，不仅能够实现外源蛋白的大量表达，而且外源蛋白可W形成正确的二 硫键和空间构象。因此，利用质体转基因植物生产药用蛋白等外源物质的研究日益受到关 注，并已经成为植物基因工程的一个新的研究热点。质体转化最早在蓝藻（1988)获得成功， 随后迅速在烟草上得到趋于完善的发展，并相继在拟南芥E、番茄和甘蓝等10余个物种上进 行了尝试。40多个外源基因先后被稳定整合进质体基因组，赋予了植物抗除草剂、抗虫、抗 病和抗旱等新的农艺性状，高丰量表达了疫苗、抗体和干扰素等药用蛋白质，尝试生产了氨 基酸、工业用酶和生物大分子等原料W3。但要实现外源蛋白在植物质体中的稳定表达，有 几个不足:一是外源基因对植物质体的遗传转化，是一个复杂且漫长的过程，通常要2-3年 才能实现，周期较长，对于急需生产应对突发疾病来说(例如SAS)，运一生产过程并不实用； 二是外源蛋白在质体中大都属组成型表达，表达产物可能有毒或干扰植物细胞的其他新陈 代谢W，抑制了植物体的正常生长。 利用植物体瞬时表达外源重组蛋白是植物生物反应器的一个重要研究方向，该体 系外源蛋白表达量高，实验周期短，而且具有相对操作简单的优势，但整体来看接种方式是 影响该体系实验效率的一个关键因素。传统的接种方式主要有摩擦接种法、叶片注射法和 离体植物组织真空侵染法，其中摩擦接种法是将含有重组基因的载体在体外转录，并通过 机械方式在植物叶片上制造伤口，然后W转录产物涂抹或喷洒于植物叶片上进行接种，该 方法操作相对比较繁琐，实验费用较高。目前常用的离体植物组织真空侵染法主要是利用 真空压力对离体的植物组织如叶片等进行接种，此方法操作简单，但是在收获 外源蛋白之前保持离体组织的新鲜度具有一定难度。叶片注射接种法是在活体植 物叶片上进行，要求植物具有2~3片展开的叶片，目前此种方法比较常用，但是在实验操作 中发现此种接种方式很难实现在植物中批量的生产外源重组蛋白。本专利技术的目的在于提供 ，利用植物质体trni和trnA基因在高等植物 中高度保守的特点，根据烟草质体的trni和trnA基因序列设计引物，从马铃馨中克隆trnl- 化nA基因区段，并W此作为定点整合的同源区段，构建包含外源蛋白基因及质体特异性启 动子Prrn和终止子化sbA的植物质体表达载体，对基因枪参数进行优化，采用基因枪轰击的 方式，在马铃馨块茎的瞬时表达了个源蛋白，验证外源蛋白的表达特性，为进一步将利用马 铃馨等作物器官作为生物反应器来表达外源蛋白快速生产药用蛋白，生物抗体等奠定基 础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，利用植物 质体化ηI和trnA基因在高等植物中高度保守的特点，根据烟草质体的trnI和trnA基因序列 设计引物，从马铃馨中克隆化nl-trnA基因区段，并W此作为定点整合的同源区段，构建包 含GFP基因（外源基因）、筛选标记基因 aadA及质体特异性启动子Prrn和终止子化sbA的马铃 馨质体表达载体，通过马铃馨块茎的瞬时表达GFP蛋白，验证外源蛋白的表达特性，为进一 步将利用马铃馨等作物器官作为生物反应器来表达外源蛋白快速生产药用蛋白，生物抗体 等奠定基础。本专利技术具体通过W下技术方案实现： -种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，包括W下步骤：[000引1)提取马铃馨幼嫩叶片中的总DNA; 2)根据马铃馨质体基因中的trnl-trnA基因序列设计合成了引物C1和C2: C1:5^-t曰曰邑邑t邑tt邑邑邑tt曰曰邑tccc邑C曰曰C邑曰邑c-S^ ; 02:5/-aactcccc邑aa邑catttc邑tc邑attactac邑CCC-3';[001引3似供试马铃馨的总DNA为模板，用高保真DNA聚合酶扩增化nl-trnA基因特异片 段，连入PUC18载体，进行序列测定，得到阳性克隆；[001引 4)设计两对引物化IUGLI2和GLAUGLA2,分别扩增阳性克隆的trn巧化rnA区段； 5)将所扩增的化nl区段分别用Clal和化nd III进行消化，连接入经Clal和化nd III内切酶消化的地io-3载体，转化大肠杆菌D册α，挑取转化菌落，获得地MLSI-GFP;[001引 6)用MlUI和EagΓ消化所扩增的trnA基因区段，连入经MlUI和EagI内切酶消化的 pBMLSI-g巧载体，转化大肠杆菌D册α，挑取转化菌落，培养后提取质粒，完成GFP基因马铃馨 质体表达载体地MLSIA-GFP的构建。 7)将连接正确的表达载体pBMLSIA-GFP用化Cl2法转化大肠杆菌D册α，挑取转化菌 落，验证正确后进行菌种保存。挑取含ρΒ化IA-GFP的D册α单菌落于lOOmL液体LB培养基中， 37°C过夜培养，参考分子克隆实验指南进行质粒大量提取，浓缩后质粒浓度达ygAU级。 8)用0.6皿金粉包埋质粒pBMLSIA-GFP后，按照标准的PDS-1000/He基因枪系统操 作方法进行基因枪转化，采用60化31、90〇931、110〇931的压力膜，轰击距离为6(3111条件下转 化马铃馨新鲜馨片(厚度2-3mm)。块茎轰击2d后在UVD-19M型紫外分析仪下观察、拍照。 9)用可溶性蛋白提取缓冲液提取块茎总可溶性蛋白，取15μ1上清进行SDS-PAGE电 泳（12%分离胶，3%浓缩胶)分析GFP蛋白瞬时表达，电泳胶块脱色后拍照，采用Glyko公司 Bandscan V5.0蛋白定量软件进行GFP蛋白表达量分析。 其中； 步骤(3)所述的引物具体为： GLI1:5，-ccatcga1:aaggtgttgggttaagt-3，； GLI2:5，-gccaagcttctgggccatcctggatt-3，； GLA1:5，_c邑邑ac邑C邑tct邑C邑ccaa邑邑aaaa邑aa_3，； GLA2:5，-gatcggccgaactccccgaag cat tt-3,。 步骤(4)中PCR扩增体系为：100化PCR反应体系中加10 XPCR反应缓冲液10化，5' 端和3 ' 端各0.2皿〇1，5U Taq DNA聚合酶，50ng模板DNA，MgCl2为2. Ommol/L，各种dNTP为 0.2mmol/L。反应条件为:95°C总变性3min，94°C变性60s，55°C退火60s，72°C延伸180s，共进 行30个循环。 本专利技术的有益效果为:本专利技术所构建的马铃馨质体定点转化载体pB化IA-GFP，可 作为构建不同作物质体表达载体的基础载体，也可W作为构建不同药用蛋白基因的基础载 体，利用该载体，可为进一步将实用基因导入马铃馨质体基因组进行稳定表达，或者利用快 速瞬时表达外源蛋白来达到生产医药用蛋白的目的。【附图说明】 图1是马铃馨质体trnl-trnA基因同源区段P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取马铃薯幼嫩叶片中的总DNA；2)根据马铃薯质体基因中的trnI‑trnA基因序列设计合成了引物C1和C2；3)以供试马铃薯的总DNA为模板，用高保真DNA聚合酶扩增trnI‑trnA基因特异片段，连入pUC18载体，进行序列测定，得到阳性克隆；4)设计两对引物GLI1、GLI2和GLA1、GLA2，分别扩增阳性克隆的trnI和trnA区段；5)将所扩增的trnI区段分别用ClaI和Hind III进行消化，连接入经ClaI和Hind III内切酶消化的pBio‑3载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，获得pBMLSI‑GFP；6)用MluI和EagI消化所扩增的trnA基因区段，连入经MluI和EagI内切酶消化的pBMLSI‑gfp载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，培养后提取质粒，完成GFP基因马铃薯质体表达载体pBMLSIA‑GFP的构建。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨正安，丁玉梅，成晓静，周丽英，卜璐璐，杨春雷，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53